【原】心衰伴心室辅助装置患儿循环miRNA变化的初步研究

非编码研究园地 2021-02-01

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论文：Variations of circulating miRNA in paediatric patients with Heart Failure supported with Ventricular Assist Device: a pilot study（心衰伴心室辅助装置患儿循环miRNA变化的初步研究）

摘要

循环miRNAs(c-miRNAs)是HF诊断和预后的有希望的生物标志物.目前还没有关于心衰患儿接受VAD植入术的研究。本研究的目的是：检查高频儿童的c-miRNAs谱；评价vad对c-miRNAs水平的影响；离体验证推测的c-miRNA靶点。

应用神经生长抑素(NGS)法测定心衰患儿VAD植入前后血清C-miRNA谱.在VAD植入前、4小时、1、3、7、14、30天，用实时PCR方法检测c-miRNA的差异表达.通过miRNA模拟转染HepG 2细胞的研究，验证了miRWalk数据库筛选的miRNA靶点。

在VAD植入后30天，对13个c-miRNAs进行修饰，与NSG的VAD前比较，其中6个c-miRNAs经Real-TimePCR证实。被证实的c-miRNAs的靶基因参与了止血过程.这个离体研究证实hsa-miR-409-3p对凝血因子7(F7)和F2有下调作用。

值得注意的是，所有患者都有需要泵改变的血栓事件。总之，在HF儿童中，VAD治疗30天后，参与调节止血事件的6种c-miRNAs的水平发生了变化。特别是c-miR-409-3p调节F7和F2的降低，可反映VAD植入后的血栓形成状态。

结果

实验设计在临床环境中，在VAD植入后1个月之前和期间，从HF儿童(n=5，研究样本)中采集血清样本(1)。为鉴定VAD治疗修饰的c-miRNA，从VAD治疗前和治疗后1个月的血清标本中分离出c-miRNA，用下一代测序(NGS)(2，发现阶段)进行c-miRNA谱分析，经精细统计分析后，用实时PCR(3，验证阶段)对测序结果进行验证。

结果经临床推广，在VAD植入后1个月内不同时间点采集的血清标本进行实时PCR检测(4)，并与VAD植入后1个月内发生的不良事件相关(5)。

最后，为了预测选定的c-miRNAs的靶区，硅中使用基因本体和miRWalk软件进行分析(6)，并对已识别和临床选择的目标进行了验证。离体特异性miRNA-模拟物转染HepG 2细胞的研究(7)。

C-miRNAs谱

应用NGS技术获取一组小儿HF患者血清miRNAs谱(N=5，补充表)。VAD植入后1个月。总的来说，平均每个样本中有340个c-miRNAs，所有样本中都有169个。C-miRNAs图谱的层次聚类分析。

显示，在全球范围内，他们并没有在VAD前后的样本中分组.然而，与VAD后相比，VAD前血清中共有13例c-miRNAs有差异(adj-p<0.1).其中9例c-miRNAs表达下调，4例c-miRNAs表达上调。差异表达的c-miRNAs的详细列表载于补充表。

测序数据的实时PCR验证

为了验证测序结果，我们还用实时PCR对13种c-miRNAs进行了定量分析.其中6个c-miRNAs的差异表达谱与NGS实验结果一致.具体来说，hsa-miR-483-3p，hsa-miR-409-3p和hsa-miR-485-3p在VAD治疗1个月后下降到无法检测到的水平。

植入VAD后，HSA-miR-432-5p呈下降趋势，hsa-miR-150-3p和hsa-miR-375呈上升趋势(图1)。选择这6种miRNAs进行下游分析。

C-miRNA识别靶区的实验验证

由于F_2、F_5、F_7、F_8、F_9和proc在肝脏中均有表达，因此，采用miRNA模拟转染技术，以HepG 2细胞为研究对象，对所选c-miRNA的靶点进行了鉴定。

转染hsa-miR-409-3p模拟物后48h细胞中F7的表达水平明显低于单纯转染miRNA(miR-CT)模拟或脂质体的细胞(见图)。此外，转染hsa-miR-409-3p后，F2的表达水平与单纯脂质体处理的对照组相比明显降低(见图)。这些结果证实hsa-miR-409-3p在HepG 2中对f7和f2的调节作用。