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今天我们一起来了解一下质粒转染相关的一些技术背景和方法，随着基因与蛋白功能研究的深入，质粒转染目前已成为实验室研究工作中经常涉及的基本方法。 DNA转染干货篇！！！质粒转染试剂的比较 一、质粒转染原理以及应用 质粒转染是指利用不同的载体物质携带质粒DNA通过直接穿膜或膜融合的方法将外源DNA分子导入真核细胞，使外源基因表达，从而针对某个基因和蛋白质的功能进行一系列生物学功能研究的方法。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断深入，DNA转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规实验工具。质粒转染在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生命科学前沿研究中，应用越来越广泛。 二、质粒DNA转染方法 质粒DNA导入细胞有多种方法，包括物理介导（电穿孔法、显微注射和基因枪）、化学介导（磷酸钙共沉淀法、载体转染法等）和生物介导（原生质体转染、病毒介导的转染）三类途径。这三类技术中，又以载体转染法最为常用。国际上应用较早的转染载体多为脂质体类载体，但此类转染载体细胞毒性较大，转染效率往往也不够理想。近年类，纳米生物材料类载体的应用逐渐增多，此类载体最大的优点是细胞毒性较低，部分品牌载体的转染效率也显著优于脂质体类载体。 三、如何选择DNA转染试剂 显然，质粒转染能否成功的关键在于质粒转染试剂的选择，目前常用的DNA转染试剂有RFect系列质粒DNA转染试剂、Lipo2000等。如何选择合适的质粒DNA转染试剂，一般可从以下几个方面考虑： 1.对质粒DNA有较高的转染效率。 转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测等方法。金标准无疑是检测目标基因的mRNA水平，因为转染试剂不仅要把质粒DNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的DNA释放出来，发挥基因表达或基因调控的作用。通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将质粒DNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因表达或基因调控效率并不高。因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。 目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列质粒DNA转染试剂、Lipo2000等。其中，Lipo2000为脂质体类转染试剂，国际知名品牌，RFect系列质粒DNA转染试剂为生物纳米材料类转染试剂，是近几年应用较广的转染试剂。RFect质粒DNA转染试剂虽在国内生产，但实际上也是在美国研发成功。就转染效率而言，RFect质粒DNA转染试剂对绝大多数贴壁细胞的转染效率可高达90%以上（EGFP质粒），另外，RFectSP悬浮细胞质粒DNA转染试剂专门针对悬浮细胞的质粒DNA转染，转染效率在大部分悬浮细胞中高达70%以上。与之相比，Lipo2000对大多数贴壁细胞的转染效率一般为75%左右，对有些原代细胞以及悬浮细胞根本无法做到有效转染。显然，从转染效率上说，RFect系列质粒DNA转染试剂更具优势。 2. 对转染细胞的毒性很小。 转染试剂如果毒性过大，会导致大量细胞死亡，这会直接影响对转染试验结果的判读和解析。脂质体类转染试剂本身会导致某些基因的表达改变，因而会影响转染试验结果的客观性。以上可见，应尽量选择毒性较小的转染试剂。 有些研究者对细胞毒性不太重视，仅仅考虑是否可将质粒DNA转染进入细胞，其结果在某些高水平的期刊，往往会导致审评的质疑。对于国内常见的几种转染试剂来说，RFect系列质粒DNA转染试剂主要由生物纳米材料制成，细胞毒性较低，转染细胞死亡率不到10%。Lipo2000属于脂质体类转染试剂，具有脂质体类转染载体固有的细胞毒性，细胞毒性往往较高，转染细胞死亡率有时在30%以上。 3. 转染细胞的种类。 目前常见的转染试剂包括RFect、Lipo2000及国内其它厂家的产品，主要转染对象为贴壁培养细胞，对悬浮细胞和原代细胞的转染效率都不是非常理想。Lipo2000对原代和悬浮细胞基本上无法做到有效转染，而且因为原代细胞较驯化的细胞株敏感性更高，Lipo2000转染后的死亡率也很高。RFect系列质粒DNA转染试剂细胞毒性较低，根据转染的细胞种类不同，可以选购RFect质粒DNA转染试剂或者RFectSP悬浮细胞质粒DNA转染试剂。 感谢大家对质粒转染、DNA转染、lipo2000等相关知识的关注，接下来我们会继续分享，请持续关注我们！ |
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