【原】一文尽览原发性肝细胞肝癌的工程化T细胞【CAR-T&TCR-T】治疗

免疫治疗在肝细胞肝癌的治疗中已经进入了一线治疗的行列，T+A方案有效的延长了晚期肝癌的生存时间，中位生存时间首次达到2年的期限，实现了晚期肝癌治疗的新突破。以免疫检查点抑制剂为代表免疫治疗仅仅是非特异性的免疫治疗其中之一，免疫治疗还包括特异性的免疫治疗。

非特异性的免疫治疗包括溶瘤病毒，非特性的过继免疫细胞治疗如TILs、NK、NKT，PD-1/PD-l1抗体，干扰素等 。

特异性免疫治疗包括工程化基因修饰的CAR-T和TCR-T细胞治疗，靶向GPC3/Epcam的单克隆抗体以及肿瘤疫苗等 。

接下来主要来回顾下工程化基因修饰的特异性细胞治疗CAR-T和TCR-T，看看CAR-T和TCR-T为我们带来了哪些改变？

【CAR-T和TCR-T的概念】

CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。

TCR-T（T cell receptor ,TCR）技术是将能够特异性与抗原结合的TCR基因转入T淋巴细胞，使其获得与表达该抗原肿瘤细胞结合并诱发T细胞杀伤肿瘤细胞的新的免疫细胞治疗模式。TCR-T细胞对表达目的抗原的靶细胞具有强大攻击能力，但是受MHC限制，且在TCR-T制备过程中较容易针对新抗原。新抗原特异性TCR-T细胞治疗是近年来抗肿瘤细胞免疫治疗技术的一个十分有潜力的方向。

CAR-T与TCR-T模式图

【肝细胞肝癌过继细胞治疗的靶点】

(1)AFP：甲胎蛋白(AFP)是在早期哺乳动物胚胎血清中发现的一种70 KDa的糖蛋白，出生后，血清水平迅速下降，到第二年时，在血清中只能检测到微量。高达50%的HCC肿瘤表达AFP。甲胎蛋白在非恶性肝脏中的表达可以发生，特别是在祖细胞亚群和慢性炎症期间，表达水平通常低于肝癌。

(2)Glypcan-3(GPC-3)是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族的成员，控制细胞分裂和生长调节。GPC-3是一种抗原，在70%以上的肝癌组织中表达，但在非恶性组织中很少表达。最近的研究表明，肿瘤细胞中GPC-3的表达越高，肝癌的预后越差。

(3)黑色素瘤抗原基因家族(MAGE)由12个成员组成，几乎只在多种恶性肿瘤的癌组织中表达。在肝细胞癌的RNA表达中，MAGE-1和MAGE-3的表达率约为68%。几种MAGE肽已被证明能在黑色素瘤患者中诱导强烈的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

(4)纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)是由180个氨基酸组成的蛋白质。作为肿瘤睾丸抗原(CTA)家族的一员，NY-ESO-1在精原细胞、初级精母细胞、卵原细胞和胎盘以及黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、胃癌和肝癌等多种癌症中均有表达。在Nakamura等人的研究中，41例肝细胞癌中有18例(43.9%)检测到NY-ESO-1mRNA。

(5)人端粒酶逆转录酶(hTERT)通过调节端粒长度，在肿瘤细胞永生化中起关键作用。据报道，80%-90%的肝细胞癌(HCC)表达hTERT。此外，含有hTERT表位的多肽能够诱导hTERT特异性细胞毒淋巴细胞。

(6)NK组2成员D配体(NKG2DL)是一种Ⅱ型跨膜锚定的C型凝集素样蛋白受体，表达于NK细胞、CD8+T细胞、γδT细胞亚群和某些自身反应性CD4+T细胞上。肿瘤基因组图谱和肝癌样本微阵列显示NKG2DL在正常细胞表面普遍缺失，但在恶性肿瘤细胞上过度表达，为CAR-T治疗提供了良好的靶点。最近的体外研究报道了NKG2D CAR-T细胞对肝癌细胞株的有效杀伤作用。

(7)上皮细胞黏附分子(EpCAM)是一种由314个氨基酸组成的I型膜蛋白，其中只有26个氨基酸面向胞浆。EpCAM具有致癌潜力，并通过释放其胞内结构域而激活，该结构域可通过与WNT途径的元件接触而进入细胞核。研究发现EpCAM在多种癌症中经常过度表达，包括肝癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。

(8)粘蛋白1糖蛋白1(MUC1)属于人类上皮粘蛋白家族，其在正常细胞上的表达对免疫系统是隐藏的，其在肿瘤上的异常糖基化(大量O-糖基化串联重复序列)创造了免疫系统识别的新表位]。体外和异种移植模型的临床前研究证实了用于CAR-T治疗的MUC1靶点。

(9)病毒抗原：病毒表面蛋白不受现有抗病毒药物的控制，通常在整合了病毒基因组的肝细胞癌中维持。在体外和小鼠中，针对HBV表面蛋白的CAR-T细胞使人类T细胞能够杀死HBV感染的人肝细胞并消除病毒DNA。

【肝细胞肝癌过继免疫细胞治疗的疗效】

TCR-T

在2020年国际肝病大会(LBO12)上，Sangro等人展示了关于基因工程亲和力增强的自体特异肽增强亲和受体T细胞(AFPc332T细胞)的令人感兴趣数据。在这项首次人肝癌研究中，患者必须是HLAA*02：01+或02：642+，免疫组织化学检测≥1+在≥20%肝癌细胞或血清甲胎蛋白≥4 0 0 ng/mL中有甲胎蛋白表达，在非癌肝组织中有≤5%甲胎蛋白表达。4例患者接受了50亿或更多的转导细胞治疗(3组3例，扩张期1例)：1例完全应答，1例病情稳定，2例进展期。队列3中的第一个患者得到了确认的部分应答(CPR)，靶病灶减少了100%；一个非靶病变在第8周仍然存在。这与血清AFP水平从基线的6531 ng/mL迅速持续下降到第12周的14 ng/mL有关。

CAR-T

2020年8月，上海仁济医院的翟博教授团队发表了GPC3-CAR-T细胞I期试验结果。在两项前瞻性的I期研究(NCT02395250和NCT03146234)中，晚期GPC3+HCC(Child-Pugh A)的成人患者在环磷酰胺和氟达拉滨诱导的淋巴枯竭后接受自体CAR-GPC3 T细胞治疗。截至2019年7月24日的数据截止日期，共有13名患者接受了19.9×10⁸个CAR-GPC3 T细胞的中位数。初步疗效数据令人振奋，2例部分缓解，1例持续稳定的患者在44.2个月后存活。3年、1年和6月的OS率分别为10.5%、42.0%和50.3%。然而，毒性是一个主要问题，因为细胞因子释放综合征(CRS)发生在9/13例患者中，其中包括1例G5 CRS。在这位患者中，输入了20.0×108个细胞，第二天，患者经历了与CRS相关的严重低血压、发热、肺水肿和血浆IL-6升高(18000pg/mL)。重症监护病房转院后，患者于第19天死于多器官功能衰竭。另外4名患者接受了大剂量类固醇治疗，其中2名患者还接受了抗IL6受体的单抗tocilizumab治疗CRS。

【存在的主要问题及可能的解决方法】

工程化T细胞目前主要存在以下五大问题：

（1）特殊的肿瘤微环境(TME)。首先，对于工程化修饰的TCR/CAR-T细胞来说可能面临间质血管限制或物理屏障，限制了T细胞接触肿瘤细胞(运输和归巢)的可能性。其次，在实体瘤中，T细胞必须面对由细胞因子(MDSC、M2巨噬细胞、Tregs、BRegs、DCRegs、CAF)和免疫抑制细胞因子(IL10、TGFb)组成的免疫抑制TME。

（2）抗原异质性的问题。抗原的异质性降低了ACT在实体瘤中的疗效。此外，在接受CAR-T细胞治疗的实体肿瘤患者中经常观察到抗原丢失。克服肿瘤异质性和抗原丢失的一个可能的解决方案是设计同时以多种抗原为靶点的T细胞。

（3）有限的扩增和持续性。在已发表的GPC3-CAR-T细胞1期结果，所有患者外周血CAR-GPC3DNA拷贝数的中位数迅速增加，在中位时间10.5d(平均13.8d)后达到峰值360.4拷贝/mg基因组DNA(范围28.0-23358.0拷贝/mg基因组DNA)，持续时间中位数19.5d(平均34.4d)，所有患者的外周血CAR-GPC3DNA拷贝数中位数在10.5d(平均13.8d)后达到峰值(28.0-23358.0拷贝/mg基因组DNA)，持续中位数为19.5d(平均34.4d)。

（4）脱靶效应。由于靶抗原可以在非肿瘤组织中共享，严重非靶标毒性的风险很高。关于细胞因子释放综合征(CRS)，在先前报道的针对GPC-3的CAR-T细胞试验中，9/13例患者发生了CRS，其中包括1例G5 CRS(第19天中毒死亡)。在实体瘤中已经描述了5级CRS，特别是当靶向ERBB2时，T细胞识别肺上皮细胞中低水平的靶抗原。

（5）临床适用性。在肝癌临床中过继细胞回输的一个主要限制与早期临床试验中选择标准的数量有关。首先，在TCR工程T细胞中，HLA限制会导致大量患者的丧失。其次，大多数试验要求肝功能Child Pugh A级。最后，如果加上强制性的PS评分，可能从这些治疗中受益的患者的潜在频率变得非常低。

从发展的趋势来看，过继免疫细胞治疗正日益向我们走来。联合免疫检查点抑制剂，局部经肝动脉给药等方法的实话，将会极大的提高过继免疫细胞治疗的疗效 。