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LC-MS生物分析方法转移失败原因分析

2021-02-08  42ZB432

来源:小桔灯网

作者:quite

我们上期介绍了生物分析方法转移的概念,以及LC-MS生物分析方法转移的具体内容等,错过的小伙伴可点击→《如何进行LC-MS生物分析方法的转移》查看。首先值得一提的是,一个成功的方法转移能够增加发送方和接收方实验室的信心。但是,由于LC-MS生物分析方法转移涉及前期准备、交流沟通、验收等内容,且每个流程的内容繁多,所以在进行方法转移时个别细节的疏忽就可能造成转移失败,而失败后的原因分析也就成了重中之重。本期小编就把LC-MS生物分析方法转移失败的原因进行了汇总,供大家参考。

原因一 发送方和接收方实验室设置的不同

一个成功的方法转移不仅取决于发送和接收双方实验室在规范生物分析方面的经验与知识,而且还取决于对被转移方法特性的理解和沟通。两个实验室在HPLC系统、质谱、移液方法、自动移液系统、试剂、试剂储存、洗板器、玻璃管硅化方法、特殊设备的使用、漩涡混合器,甚至通风橱的气流量等方面的微小不同,都可能导致方法转移验证的失败。因此,对于发送和接收双方实验室而言,在方法转移之前应就方法的细节进行清楚沟通,这至关重要。

原因二 物质的稳定性原因

被分析物或其代谢产物的稳定性也能影响样品分析的重复性和准确性。造成待测化合物或其代谢产物不稳定的因素有许多,包括酶催化降解(如含酯药物或者药物前体)、化学反应(如硫醇化合物)、儿茶酚类的自动氧化、内脂和羟基羧酸的互相转化(如他汀类化合物)、氮氧化物的降解及Ⅱ相代谢产物降解、手性/差向异构/互变异构/同分异构互相转化等。在以上原因中,以Ⅱ相结合物(如酰基葡萄糖醛酸)的代谢产物在样品储存、处理或色谱分析过程中降解为母体被测物的过程最为常见。不稳定的Ⅱ相结合物的降解无疑会导致对母体化合物浓度的高估及已分析样品在接收方实验室重新分析时明显的正向偏差。复审被测物和代谢产物的稳定性并测试相关稳定性是至关重要的。如果被测物确实包含不稳定的代谢产物,应当对液相色谱-质谱(LC-MS)分析之前的样品收集和处理有些额外的稳定措施。任何发现都应当向接收方实验室交代清楚。

原因三 不合适的方法选择性

分析方法选择性的评估应当用6组不同基质配制的LLOQ浓度样品。在这6个LLOQ浓度样品中,5个分析结果的偏差值应在标示浓度的±20%内。对于一些难以获得的基质,可以用少于6组的基质来进行选择性测试;在转移之前,甚至可用一组合并的基质来进行测试。测试单组基质会掩盖不同组基质间的区别,这会在样品分析选择性不佳的情况下导致方法转移的失败。除一些常见的内源性组分(如磷脂)外,已知或者未知的代谢产物,给量媒介,以及同时服用的药物,都会导致分析选择性的不足。

对分析物进行色谱分离的主要依据是分析物和基质组分相对于移动相和HPLC柱上固定相的物理化学性质的不同。当质谱在单反应监测或者多反应监测(MRM) 模式下工作时,干扰会比较少。大气压离子化技术[如电喷雾离子化(ESI)和大气压化学离子化(APCI)] 被普遍认为是“软性”的分析技术。然而,任何有弱键的分子都能够在进入串联质谱Q1室之前的电离过程中裂解(源内裂解)。如果生物样品提取物中存在分析物的氮氧化、硫氧化、葡萄糖醛酸或者硫酸共轭等代谢产物时,这一“源内裂解”尤其明显。这些代谢产物的源内裂解可产生和母体化合物前体离子相同的离子。在高通量液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析中,色谱分离效果往往因为大大缩短的液相色谱分离时间而受到影响。如果发送方和接收方实验室的色谱条件有所不同,代谢产物的源内裂解可能造成发送和接受方实验室测得的已测样品浓度明显不同。在这种情况下,常常需要在一方或双方实验室对色谱方法进行修改以便重新进行方法验证。

原因四 常见实验操作差错

对已测样品再分析(IS R) 的失败可能并不是由分析方法本身的问题(选择性或者稳定性问题)引起的,而是由实验操作的差错引起的。这些差错包括但不局限于:①样品没有充分融化,②在取样之前样品不均匀,③样品稀释不当,④样品标识不清。鉴于此,应该确保对实验室人员的正确训练。

方法转移失败的调查

对任何方法转移的失败,都应进行必要的调查。对此,发送方和接收方实验室必须有一个双方认可的书面程序(如方法转移协议或者协议修正案)。

一般而言,调查会包括两个阶段:阶段Ⅰ,对现存的数据和文件进行审阅;阶段Ⅱ,实验室调查,发送方和接收方实验室可能都需进行。

在阶段Ⅰ的调查中,文件审阅应当集中在样品标识、准备、数据处理、计算过程中的错误,或者LC-MS系统中可能的错误设置等方面。在结束阶段Ⅰ的调查时,应有以下3项可能的结果:

①找到了明确的原因,即确认了方法转移失败的根本原因;

②找到了可能的原因,即方法转移失败的原因有可能被确认,或者被缩小到几个可能的原因;

③没有找到明确的原因,即无法确认直接的原因。

如果找到了可以归咎的原因,应马上进行改正。有时对数据处理和计算上的一个简单改正便可能结束调查。当然,应当进行必要的相关培训以防类似情况再次发生。

在找到一个或者多个可能的实验室操作或者仪器错误的情况下,应当进行阶段Ⅱ实验室调查,以确认根本的原因。基于测试的结果,可以作出以下判断:

①可归咎的原因被确认;

②没有找到可以归咎的原因。

对于前一点,应马上开始多方面的工作,包括但不限于对样品的重新分析。对于后者,应当进行更深入的调查,如果可能,发送方实验室也应进行相应的调查。在对方法进行仔细审查时,应当评估以下因素的可能影响:不合适的样品准备,未知不稳定代谢产物,分析物和内源性化合物不理想的色谱分离,方法选择性不理想等。应当进行一个或多个实验,以确认可能的根本原因。这种调查可能导致一个简单的步骤修正和样品重新分析,也可导致对生物分析方法的重新开发和重新验证。

根据目的的不同,一个生物分析方法的转移可能简单到单批次交叉验证,也可能是一个全面验证。在目前制药行业将越来越多地将药物后期研发工作外包给CRO(尤其是新兴市场的CRO) 的趋势下,方法全面验证可能成为必要。无论如何,方法转移的结果都应符合药物监管部门的要求。因此,发送方和接受方实验室都应该协力合作。所有技术方面的挑战都应当通过合适的渠道进行讨论,包括实地访问或培训。接受方实验室不应惧怕质疑方法的可转移性。

最后,一个成功的方法转移不但可以降低药物开发的成本,而且有助于双方实验室建立长期的合作关系,实现双赢。

  

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