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题目：肿瘤浸润淋巴细胞signature可作为一种新的抗PD-1/PD-L1疗效的泛癌预测生物标志物 参考文献：https://www./2072-6694/12/9/2418 一、研究背景 免疫治疗的迅速发展为广大癌症患者带来了福音，但目前被广泛用于预测免疫治疗疗效的方法仍然只有基于PD-L1的免疫组化评估，在目前的临床应用中还远远不够。在本篇学习笔记中提出了一个包括40个基因的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)signature评分，希望通过深入探究TIL评分以及其中包含的淋系和髓系评分在各类癌症中的特征以及预后预测性能，为免疫治疗相关分子标记的进一步的研究奠定基础。 二、研究流程
三、结果解析
1.泛癌TCGA队列中TIL以及淋系、髓系评分的特征 在本文中，TIL评分由4个10-gene signature组合而成，这4个signature分别被用作评估淋系、髓系、基质和肿瘤细胞含量。根据肿瘤类型的不同，TIL评分为淋系+髓系两项评分的组合或上述四项的组合。计算了TCGA泛癌队列中32种癌症类型的8975例患者的TIL评分之后，可发现评分在不同肿瘤类型之间存在差异(图1A)，而单独对患者使用淋系评分(图1B)和髓系评分(图1C)的结果也显现出各自不同的分布情况。 随后，对TIL评分、淋系评分和髓系评分之间的相关性进行探索(图1D)。因为TCGA泛癌数据集还包含了代表性的HE染色图像，使用人工智能软件基于这些图像对13种癌症类型的3304例患者的TIL进行了量化分析并将分析结果纳入相关分析中。另外，还纳入了TCGA中的另一个经典评估变量——基于甲基化情况计算的白细胞评分。上述5个变量之间的相关矩阵显示这些评估方法之间存在弱但显著的相关性，且根据HE染色估算的TIL评分与淋系评分的相关性比与髓系评分的相关性高(图1D)。上述结果提示基于基因signature的TIL评分是一种可以用来估计TCGA泛癌队列中淋系和髓系两种细胞含量的方法，而根据HE染色估算的TIL评分以及基于甲基化情况计算的白细胞评分可能更适合于研究淋系细胞的富集而非整体的免疫浸润情况。 
图1.A，B，C.TIL评分、淋系和髓系评分在TCGA泛癌队列中的情况(数据经过标准化)；图1D.基于HE染色的TIL评分、淋系评分、髓系评分、基于基因signature的TIL评分以及白细胞评分之间的相关情况
2.TIL、淋系和髓系评分相关的免疫细胞 MCP-counter是一种通过量化RNA测序结果来评估肿瘤中8个主要免疫细胞和2个基质细胞群体丰度的方法。对上述细胞对应的10个变量与TIL、淋系和髓系评分的相关分析发现：除中性粒细胞以外，MCP-counter包含的所有免疫相关变量与TIL评分、淋系评分和髓系评分之间都有很强的相关性，而成纤维细胞和内皮细胞与上述三种评分之间则未发现相关(图2A)。 接下来，进一步评估了TIL评分对淋系和髓系细胞在瘤床中丰度的代表能力。具体方式是运用LASSO模型从MCP-counter的10个变量中选择最佳的能够预测TIL评分的变量。结果显示在各种癌症类型中，平均需要7个(范围为5-10，图2B)MCP-counter的变量来预测TIL，提示TIL能较好地描述肿瘤免疫的情况。为了进一步深入探究，又用上述LASSO模型探究了不同癌症类型中预测淋系和髓系评分所使用的MCP-counter中的变量情况(图2C，D)。 在上述结果中，可以发现，在大多数癌症类型中，预测TIL评分最重要的两个变量是T淋巴细胞和单核细胞，而对于淋系评分的预测，最重要的变量是T细胞和B细胞，还有重要性稍低的NK细胞和细胞毒性淋巴细胞；对于髓系评分则是单核细胞，这一发现表明TIL评分可以较好地代表TCGA泛癌队列中T淋巴细胞和单核细胞丰度，而淋系评分可以代表T细胞、B细胞以及较低程度上代表NK细胞丰度，髓系评分则是单核细胞丰度的良好指标。 
图2A.TIL、淋系和髓系评分与MCP-counter中10个变量的相关分析；图2B，C，D.使用LASSO模型基于MCP-counter预测TIL、淋系和髓系评分时使用的变量情况
3.TIL signature在泛癌TCGA队列中的预后评估 接下来，对TIL评分以及淋系和髓系评分在TCGA泛癌队列中预测预后的能力进行评估，将它们与两个作为黑色素瘤免疫检查点阻断疗效预测的signature——IMPRES和IPS进行了比较。IMPRES包括15对免疫检查点基因，IPS则是效应细胞，抑制细胞，主要组织相容性复合体(MHC)相关分子，检查点/免疫调制剂四个评分的总和。将TIL、淋系和髓系评分视为连续变量，通过单变量Cox模型评估了这些变量预测总生存期(OS)和无进展间隔(PFI)的能力(图3A，B)。以对OS的预测作为参考基准，TIL、淋系和髓系评分与IPS和IMPRES评分对预后的预测能力以及预测结果都较为相似，但前三种评分对头颈部鳞状细胞癌以及微卫星不稳定状态的结肠癌具有显著的更好的预测性能。以对PFI的预测作为参考基准分析也观察到了类似的结果。上述结果表明TIL，淋系和髓系三种评分可以提供与IMPRES和IPS相同以及互补的预后信息。 下一步，将TIL，淋系和髓系评分与IMPRES和IPS预测OS和PFI的时间依赖性ROC曲线的AUC进行了比较，发现TIL、淋系和髓系评分的AUC非常接近，但在预测9种癌症的OS以及10种癌症的PFI时，它们的表现优于IMPRES和IPS(图3C，D)。为进一步探讨TIL对肿瘤预后预测的贡献，首先构建包含年龄、性别、肿瘤类型和肿瘤分期的Cox模型，随后又将基于基因signature的TIL评分和基于HE染色评估的TIL评分添加到模型中。以OS作为比较基准，发现基于基因signature的TIL评分在9种癌症类型中提高了预后预测的准确性，而基于HE染色的TIL评分没有提高模型的精度。在类似的分析中，可发现淋系评分在6种癌症类型中提高了预后预测的准确性，而基于HE染色的TIL评分依然没有类似效果。这些数据共同说明TIL评分是TCGA泛癌队列中与OS和PFI相关的一个强有力的预后预测指标，而且提示免疫肿瘤微环境的整体评估对患者的预后预测有重要作用。 
图3A，B.TIL、淋系和髓系评分以及IMPRES和IPS在不同癌症类型中与患者预后的关联；图3C，D.TIL、淋系和髓系评分以及IMPRES和IPS预测不同癌症类型患者预后的性能对比
4.用于预测对抗PD-1/PD-L1或CTLA-4反应的TIL评分的评价 随后，对TIL、淋系和髓系评分是否可以作为多个癌症类型的PD-1/PD-L1抑制剂疗效的生物标志物进行探究。为此参考了Yarchoan等人的meta分析——文章中总结了在几个已发表的临床试验中单独使用PD-1/PD-L1抑制剂的客观缓解率(ORR)。依据这些数据，评估了多个癌症类型中TIL、淋系和髓系评分的中位数与PD-1/PD-L1抑制剂使用后ORR之间的相关性(图4A-C)，观察到TIL和淋系评分都与PD-1/PD-L1抑制剂使用后ORR有关，淋系评分的相关系数略高于TIL评分；但髓系评分并未观察到类似的相关。另外，还对经典的生物标志物肿瘤突变负荷(TMB)、扩展免疫signature(EIG)和PD-L1(CD274)表达进行了类似的分析，与预期一致，所有这些变量都与PD-1/PD-L1抑制剂使用后ORR显著相关。评估了TMB、EIG、PD-L1表达和淋系评分四者之间的相关情况，发现TMB与EIG，TMB与淋系评分之间都没有关系，但EIG、PD-L1和淋系评分三者之间存在密切相关(图4D)。 
图4A，B，C.不同癌症类型的TIL、淋系和髓系评分与应用抗PD-1/PD-L1疗法后ORR的关联；图4D.TMB，ORR，CD274表达，淋系评分和EIG的相关分析 随后进行了包括TMB、EIG、PD-L1表达和淋系评分这几个变量的多因素线性回归，以得到预测ORR的最佳模型(表1)。使用AIC(一个反映统计模型拟合优良性的指标)作为参考，建立了TMB+淋系评分的最佳模型。用ANOVA对单独使用TMB和使用TMB+淋系评分的模型进行比较，发现淋系评分显著改善了模型的预测性能(p=0.05)。上述结果提示：单独使用淋系评分或者淋系评分+PD-L1表达/TMB的模型有潜力作为简单而普适的预测免疫检查点抑制剂的疗效的方法。 
表1.包含TMB、EIG、PDL1(CD274)表达和淋系评分的多因素线性回归结果 最后，为了验证上述结论，分析了应用PD-1/PD-L1或CTLA-4治疗的患者的数据集，观察到高淋系和TIL评分与更好的无进展生存有关(图5A，B)。在另一个队列中也证实在转移性黑色素瘤的抗CTLA-4治疗中，高淋系和TIL评分与更好的无进展生存有关(图5C，D)。在另外两个应用PD-1/PD-L1疗法的队列中，高淋系评分也与更好的结果有关(图5E，F)。使用AUC作为评估标准，可发现基于淋系评分或TIL评分比经典signature(如EIG或免疫浸润)预测患者预后的性能更好(图5G-J)。接下来对两个队列中将TIL和淋巴评分与IMPRES、IPS和TIDE进行比较(图5G、H)。TIL评分在Dijon-Montreal队列中表现最好，但在Van Allen队列中表现最差，淋系评分表现则较为稳定。值得注意的是，在GSE数据中，因为相关基因表达数据缺失，TIL评分、IMPRES、IPS和TIDE无法被计算。 
图5A-F.TIL和淋系评分高与低的患者无进展生存期的差异；图5G-J.基于TIL评分、淋系评分、CD3E、IPS、IMPRES以及TIDE在不同数据中对患者预后的预测性能 在本篇学习笔记中提出了多种不同的可用于预测肿瘤预后的评分方法，通过泛癌分析，相关分析，LASSO模型等手段探究了这些评分之间的关联以及各自适用的范围，最终证明了基于40个基因的TIL评分以及其中包含的基于10个基因的淋系评分在肿瘤预后和免疫治疗疗效中的预测价值，而40或10个基因的模型相比于先前的模型体量也相对较小，更有临床应用的价值。
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