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Real time qPCR主要是通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。常用的荧光标记方法有SYBR green Ⅰ染料和TaqMan 探针两种。而定量分析则分为绝对定量和相对定量。该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。 原理简介1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied Biosystems公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 扩增曲线
在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。 在荧光信号的指数增长期，DNA拷贝数是呈指数形式增加的，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 PCR理论方程
荧光标记SYBR green Ⅰ
数量关系：每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去。而染料一结合，就会产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。 熔解曲线：利用荧光染料SYBR® Green I做荧光定量PCR检测时，可以利用熔解曲线(Dissociation curve)可以用来判断产物的特异性。Tm值（Melting Temperature，解链温度），即PCR双链产物的退火温度。下面两个图是在荧光定量PCR结束后，对产物进行逐步升温时进行的监测，可以看到在达到其解链温度时，荧光信号会有一个忽然的下降。我们将测得的这个曲线叫做熔解曲线。理论上如果PCR得到特异性产物，那么则只有一个Tm值，在溶解曲线上表现为只有单峰存在。如果是多相峰，那么可以判断产物不是单一的，发生了非特异扩增。
TaqMan 探针
TapMan探针的基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团（R），3'端标记淬灭基团（Q）。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基团因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，当延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。 数量关系：每产生一条DNA链，就切断一条探针，从而产生一个荧光信号，荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。 TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。 分子信标Taq Man探针衍生了分子信标 (Molecular beacons) 。分子信标结构为发夹形状, 主要是单链DNA形成, 两段分别标记报告基团和淬灭基团, 荧光报告基团会在发夹结构形成时靠近淬灭基团, 发生FRET, 构象会在热循环温度达到分子信标解链温度时出现改变, 可以结合模板形成线性分子, 线性分子具有延展性, 能够促使FRET消失, 同时荧光信号由报告基团发出。 复合探针复合探针法是将Light Cycler和分子信标两种技术的优势充分结合应用, 首先将荧光探针和淬灭探针结合, 两探针分别包含5'端接荧光分子和3'端接淬灭分子, 两者可以实现杂交。两种探针如果在没有模板的溶液中仍可以特异结合, 淬灭探针会吸收荧光探针发出的荧光, 此时荧光并不会产生在容易当中;两者在有模板的溶液中且温度较高情况下可以结合模板, 从而分离两探针, 此时有荧光产生。溶液中模板数量越多, 荧光强度会越大, 所以能够根据荧光强度定量分析PCR。 绝对定量和相对定量绝对定量绝对定量是指确定待测样品中某一目的基因的绝对量值，即确切拷贝数。 一般采用标准曲线法。 绝对定量中，log（起始浓度）与循环数呈线性关系，即 一般，DNA样品的定量标准品为基因组DNA或质粒，RNA样品的定量标准品为TotalRNA、cDNA和体外转录RNA。绘制标准曲线的标准品梯度的选择一般为5~6个梯度，标准品的稀释倍数通常为10。 标准曲线的各项指标：斜率、扩增效率（E）、相关系数（）、间距均需进行严格评价，从而确保该曲线的可用性。各点间距应相等，间距以及斜率的绝对值应满足3.100～3.582，相关系数>0.99，扩增效率（E）在90%～110%之间。扩增效率、斜率以及间距三者相互关联，扩增效率，斜率的绝对值恰是各点之间的平均间距。当扩增效率<90%时，间距以及斜率的绝对值会>3.582；当扩增效率>110%时，间距以及斜率的绝对值会<3.10，故扩增效率越低，斜率的绝对值越大，间距越宽；扩增效率越高，斜率的绝对值越小，间距越窄。扩增效率过低，酶的活性可能出现了问题，或反应体系不适合反应的有效进行。若扩增效率过高，反应管内可能存在目的基因扩增之外的其他非特异扩增，需要对引物进行一个溶解曲线的检测，优化反应体系以及反应程序。 相对定量相对定量用于确定待测样品中某一目的基因在不同条件下的表达差异（倍数关系）。其结果必须用内对照基因（管家基因）校正。管家基因通常指维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH/Actin/18srRNA等，实际操作中可依据文献或具体实验进行筛选。 相对定量的分析方法主要有两种：双标准曲线法和法。 双标准曲线法： 每次实验都要分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线，并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后通过公式就可以计算出目的基因的表达差异。利用该方法需生成标准曲线，操作严谨复杂，但计算结果准确，误差小，对结果要求较高的分析通常采用该方法。 法： 此方法通常用于某一基因在mRNA水平上的表达量分析。 实际应用由于实时荧光定量PCR技术较常规PCR技术相比，具有污染少、定量准确、实时监测、自动化程度高等优点，该技术已被应用于转基因检测、作物育种、环境科学、医学诊断、海关检验检疫、国防军事、基础研究等领域。 |
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