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作者：俞彤 前言 系统学习PCR相关知识并从事新冠检测有半年的时间，对一些问题也进行了一些思考，和各位老师进行讨论。 实时荧光RT-PCR作为临床上使用最广泛和技术成熟度最高的方法，将RT-PCR与qPCR结合，可以不用进行后续的跑胶、拍照等处理，通过实时动态监测荧光信号的变化，来了解反应情况。 RT-PCR扩增的基本原理 与一般PCR不同，RT-PCR包括RNA逆转录和PCR两个过程。在实际操作检测中，商品化的试剂通常都是一步法反应，即逆转录与PCR在一管内完成，这样既方便操作节约时间，也避免了开盖导致污染的可能性，同时由于cDNA产物都进行PCR扩增，也提高了敏感性。 1、逆转录反应 反应体系包括逆转录酶，逆转录引物和dNTP。逆转录酶的主要酶活性包括依赖于RNA的DNA聚合酶（RDDP）活性、核糖核酸酶H（RNaseH）活性、依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）活性，分别催化与RNA互补的cDNA链合成，RNA的水解以及双链cDNA的合成。在可能影响逆转录过程的因素中，逆转录酶的热稳定性、RNaseH活性、cDNA持续合成能力都会导致不同试剂逆转录过程效率的差异。比如，热稳定性高的逆转录酶，可以提高逆转录反应的温度，而反应温度较高有利于减少RNA二级结构对引物结合效率的影响，所以，这就是为什么很多试剂盒的逆转录温度设置在50℃而非传统的42℃。 2、PCR 基本反应步骤为：变性-退火-延伸。但是在实际工作中，通常扩增的片段比较短（100~200bp）,不需要达到酶的最适温度，在退火温度及退火-变性的温度变化过程中完成短序列的延伸。以武汉明德试剂为例，按照最常用的Taq酶在72℃下的催化效率约为1200bp/min来看，60℃，反应时间为40s,已经能够很好的完成目的序列的扩增，并节省时间。 关于内对照 为了避免标本采集、核酸提取和PCR反应过程中可能产生的假阴性结果，试剂盒通常包含内对照，内对照在实时荧光RT-PCR反应体系中和靶核酸同时完成扩增反应。内对照可以分为两种。一类为内源性，如RNaseP等人源基因，这些基因在人体各器官组织细胞中普遍存在且与病毒结构相似，存在于采集的咽拭子等标本中，因此可以监测是否采集到了细胞及整个实验操作过程的准确性。但是由于人基因组和病毒提取效率存在一定差别，因此内源性内对照无法完全监测提取过程存在的问题。如果内对照无扩增曲线，则提示实验环节存在问题，该标本实验无效（并不是该次实验无效）。复查时可再次对样本进行提取（以下简称B），同时将第一次提取的模板（以下简称A）与该次提取的模板进行PCR。若A依然无扩增曲线，B有扩增曲线且Ct值符合说明书要求，那么基本可判断是提取环节出现问题；若AB均无扩增曲线，则可基本判断为采样不合格，需重新采样；若AB均有扩增曲线且Ct值符合说明书要求，大概率为第一次加样“漏孔”。 靶核酸质量的影响 病毒靶核酸的提取纯化是指将靶核酸从病毒中释放出来的，失活核酸酶，消化结合于核酸的蛋白质，然后将蛋白质和脂类等可能抑制Taq酶活性、干扰核酸扩增的物质从待测RNA中去除的过程。一般采用的方法为磁珠分离法，目前使用最为广泛的硅胶质膜磁珠采用表面化学修饰法在磁性四氧化三铁纳米粒子表面包裹二氧化硅，并在此基础上加入各种活性基团的修饰，以硅羟基磁珠最为常见。磁珠在高盐低ph值环境下，二氧化硅表面的羟基与RNA分子形成氢键并发生结合；低盐高ph值环境下，RNA分子被释放出来。通过移动磁珠，进行洗涤和洗脱。临床标本及靶核酸提取过程中，可能存在的抑制和干扰物质包括：内源性干扰物质，如血红蛋白、脂肪、糖原、细胞成分、钙离子和DNA结合蛋白；外源性干扰物质，如手套粉、酚类化合物、乙醇、甚至是塑料制品等。实验室曾有一次实验，所有样本的内对照都是阴性，阳性对照正常。分析实验过程后发现是操作人员在安全柜内误喷了大量酒精，造成干扰。所以设置内对照非常有必要，不仅能监测采样和提取，还可以提示扩增抑制物。 结语 以上是我个人在实验过程中遇到的问题，通过查阅资料和书籍获得的一些了解，如有不当之处还请各位老师不吝赐教，希望能够在PCR这一技术上得到更大进步。 |
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