【原】冷冻消融联合同种异体NK细胞治疗进展期肝细胞肝癌可有效提高客观缓解率

氩氦刀冷冻消融是一种介入治疗，是新型的微创治疗技术。可在X光、B超、CT或腔镜引导下直接将消融针准确地穿入肿瘤组织，将肿瘤组织冷却至 -160℃至-180℃，在癌细胞内迅速降温，形成胞内冰晶，导致组织内肿瘤细胞脱水和破裂，并破坏肿瘤内小血管而致缺氧，死亡的肿瘤组织可作为抗原，促进机体发生抗肿瘤免疫反应。氩氦冷冻消融比射频，微波可以达到更大范围的消融，从而减少患者的疼痛，达到较为满意的控制肿瘤的效果。冷冻消融已经广泛的用于不可切除的肝细胞癌的局部处理。

有关冷冻消融的主要机制虽然没有一致性的结论，一般认为具有以下几点：

• 细胞直接损伤：在冷冻过程中，细胞即有冰晶形成，引起细胞外溶质浓度增大，渗透压差导致细胞内水分流到细胞外引发细胞脱水，进而引起细胞的代谢和功能障碍；当温度进一步降低至-40℃以下时，细胞内便形成均质性，细胞器如线粒体、内质网因此发生不可逆性损伤，最终导致细胞死亡。有研究认为较快的降温速度主要促使细胞内冰晶形成，缓慢降温主要引发渗透压差导致的细胞损伤。

• 微血管衰竭：此种损伤主要发生在冷冻的复温期，表现为微血管衰竭、循环中止和细胞缺氧。冷冻导致血液瘀滞，引发循环受阻是细胞损伤的另一个重要机制。冷冻消融过程中，随着温度的降低，血管收缩明显，血液流速减慢，细胞缺氧导致血管内皮细胞损伤，引起微血栓聚集，加重了组织缺血、缺氧的进程。在复温过程中，当温度上升至80℃时，血管舒张，血管充血，造成血管通透性增加，内皮细胞损伤严重，有研究表明冷冻消融术后发现血管内皮细胞和细胞间连接处在复温两小时后破坏明显。

• 细胞凋亡：在亚低温下，冷冻主要引起靶细胞凋亡。Hollister研究发现当细胞所处温度低于-15℃的温度时，细胞主要发生坏死，当温度高于-5℃时，凋亡为主要的致死机制。在冷冻消融过程中，冰球边缘的区域为亚致死性损伤，研究显示亚致死区域内术后12小时以细胞凋亡为主。

• 抗原释放与免疫增强：冷冻消融导致肿瘤细胞坏死，可导致肿瘤抗原完整释放释放在细胞膜表面并被抗原提呈所吞噬，冷冻消融后树突细胞内的抗原数量远远超过热消融，因而能诱导机体产生更强烈的免疫反应。冷冻治疗还可以刺激NK的活性，诱导细胞毒性T细胞进而释放出酶并且杀灭细胞。

NK细胞全称自然杀伤细胞（Natural Killer Cell），具有细胞毒性和免疫调节双重功能。NK 细胞是自然免疫的重要成分，通过直接攻击应急的、感染的和变质的细胞，对机体保持内环境稳定发挥着重要作用。NK细胞源自骨髓造血干细胞，通过识别自体MHC I分子的训练后获得区分“敌我”的能力。同种异体NK细胞过继转移治疗在AML患者中显示出阳性反应，随后的研究也显示了在老年和儿童AML患者中使用单倍体相合的NK细胞的令人鼓舞的结果。同种异体NK细胞过继免疫疗法治疗实体瘤的临床疗效也被几个小组评估。多次异基因NK细胞输注与晚期癌症(包括Ⅲ期胰腺癌)的预后较好相关。晚期非小细胞肺癌的同种异体NK细胞免疫治疗在临床上也显示出显著的益处。

那么，将冷冻消融与同种异体NK细胞回输联合用于进展期肝细胞肝癌，能否取得1+1＞2的疗效呢？

一项小样本的研究评价了冷冻消融（Cryoablation）联合同种异体自然杀伤细胞（NK）免疫治疗晚期肝癌的临床疗效。自2015年10月至2017年3月，共纳入符合入选标准的患者61例，分为两组：1)单纯冷冻消融组(n=26)；2)冷冻消融联合同种异体自然杀伤细胞组(n=35)，首先评估其安全性和近期疗效，然后评估中位无进展存活率、应答率和疾病控制率。记录患者经历的所有不良事件，包括局部反应(如疼痛、胸腔积液和腹水)和全身反应(如寒战、疲劳和发烧)，发热更为频繁。没有检测到其他可能的严重副作用(例如，血液或骨髓改变)。同种异体自然杀伤细胞与冷冻联合治疗具有协同作用，不仅增强了患者的免疫功能，改善了患者的生活质量，而且降低了甲胎蛋白的表达，具有良好的临床疗效。

中位随访8.7月(3.9月~15.1个月)，中位无进展生存期(9.1月)明显高于冷冻组(7.6月，P=0.0107)，接受多种自然杀伤细胞治疗的中位无进展生存期(9.7个月)高于单一自然杀伤细胞组(8.4个月，P=0.0011)，有效率(60.0%)高于冷冻治疗组(46.1%，P<0.0011)。冷冻组的疾病控制率(85.7%)明显高于冷冻组(69.2%，P<0.01)。经皮冷冻消融联合同种异体自然杀伤细胞免疫治疗显著提高了晚期肝癌患者的中位无进展存活率。多个同种异体自然杀伤细胞输注治疗晚期肝癌预后较好。

越来越清楚的是，肝癌患者肿瘤的发生和发展受到肿瘤免疫的影响。最近免疫治疗的成功突显了基于免疫的治疗方法在晚期肝癌治疗中的潜力。冷冻消融后，由于持续的抗原释放，可以顺次刺激免疫系统。联合治疗表明，同种异体NK细胞联合冷冻治疗晚期肝癌显示出协同效应，显著提高了患者的免疫功能。同种异体NK细胞免疫治疗后NK细胞数量的增加可能与外源性NK细胞被放大有关，因为NK细胞是在对数期输注的，其活性最高，并且是按顺序扩增的。综合治疗能明显延长中位PFS，多疗程NK组中位PFS高于单疗程NK组，RR、DCR亦高于单疗程NK组(P均<0.05)。

几十年来，自然杀伤(NK)NK细胞作为“非特异性”杀伤细胞存在，不同于CTL或其他免疫细胞识别的靶细胞。NK细胞通过其杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)被训练来识别细胞表面的“非自身”组织相容性抗原(人类白细胞抗原，HLA)。最近的发现更好地解释了NK细胞如何识别和杀死它们的靶细胞，以及它们产生免疫活性细胞因子的能力，这使得它们成为更具吸引力的免疫治疗工具。虽然是单中心的临床研究，样本量亦不大，但可以看到同种异体NK细胞治疗联合经皮冷冻治疗晚期肝癌患者具有良好的疗效，提示了一种潜在的新的治疗策略。