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摘要:病害是全球养殖对虾生产的主要限制因素之一。2009年，黑虎斑节对虾（Penaeus monodon）的微孢子虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）被正式定性为一种罕见的黑虎斑节对虾感染的虾肝肠孢虫。2010年之前，它相对未被详细研究。此后，作为亚洲最常见的虾种之一，太平洋南美白对虾（Penaeus vannamei）感染虾肝肠孢虫变得越来越普遍。虾肝肠孢虫感染宿主的肝胰腺，引起肝胰腺微孢子虫病（hepatopancreaticmicrosporidiosis，HPM），这是一种与水产养殖环境中宿主生长缓慢相关的疾病。1.1 肝胰腺微孢子虫（HPM）和虾肝肠孢虫（EHP）的历史 肝胰腺微孢子虫（HPM）是三种已知养殖对虾的肝胰腺疾病，包括斑节对虾（P. monodon）、南美白对虾（P. vannamei）和南美兰对虾（P. stylirostris）以及一种疑似对虾（日本对虾，P. japonicus）。该病是由肝肠孢虫感染引起的。肝肠孢虫是一种微孢子虫病原体，首次在泰国正常和生长迟缓的黑虎虾的肝胰腺中被报道。后来根据组织学、超微结构和系统发育数据，于2009年被正式描述为虾肝肠孢虫（EHP）。这种寄生虫的孢子超微结构也类似于另一种先前在1989年从马来西亚的斑节对虾和2001年澳大利亚的日本对虾中报道的不具典型特征的肝胰腺微孢子虫。这些早期研究表明，在几个对虾物种中可能感染（现在已知的）类EHP微孢子虫中，在1990年虾养殖业扩张之前，类EHP微孢子虫在澳大拉西亚太平洋地区呈地方性流行。 尽管在早期的描述中观察到了肝肠孢虫的低发病率和低强度感染，但由肝肠孢虫引起的肝胰腺微孢子虫现已在亚洲对虾养殖业中达到了流行的程度。虽然在20世纪90年代和21世纪初，与其他流行的虾类病原体相比，斑节对虾很少受到关注，但从2002年左右开始，南美白对虾在亚洲广泛养殖后，其放养密度大大提高，这可能是一种天然的条件，引起了肝肠孢虫作为一种重要的病原体的出现。经常有报道称，在培养的南美白对虾中，肝肠孢虫感染可能与白粪综合征（white fecessyndrome，WFS）有关。然而，后来的一份报告指出，这可能是一种间接的联系，而不是直接的联系。 在虾池中，虾肝肠孢虫是通过吞食受感染的虾的粪便中释放的孢子或被感染的虾的同类相食而水平传播的。在实验室的共居实验中，用网箱将受感染的虾从自然虾中拖拽分离出来。在攻毒试验中，通过返饲和口服注射方式从受感染的肝胰腺组织中纯化出的孢子也成功获得了感染。口服攻毒试验证明，虾肝肠孢虫孢子只有通过摄食才具有传染性。由于返饲法被认为是一种不受阻碍的直接接触细菌和毒素的途径，它证明了在肝胰腺中产生的孢子（大小与细菌相似）可以在内部将虾肝肠孢虫传播给未受感染的肝胰腺小管上皮细胞（自身感染）。通过向培养水中添加虾肝肠孢虫感染的组织匀浆，也实现了向幼虾苗的水平传播。这些结果表明，虾肝肠孢虫可以通过在各生命阶段孢子感染或同类相食的对虾中迅速传播。如前所述，虾肝肠孢虫的储藏宿主或机械载体也可能存在，但这种可能性尚未得到证实。提出了虾肝肠孢虫垂直传播的观点，并对感染虾肝肠孢虫的无节幼体、蚤状幼体1和蚤状幼体2期进行了PCR检测，结果均为阳性。不幸的是，这种说法并没有伴随明确的组织学检查。也没有报道无节幼体的阶段，这使得感染可能是通过摄入亲虾（发育到性成熟阶段的虾）粪便中释放的孢子而不是通过性腺细胞引起的。 一些已发表的研究质疑了虾肝肠孢虫感染与白便综合征（WFS）之间的关系。这是指在养虾池中出现白色中肠和大量堆积白色漂浮的粪串。这种临床特征有时在感染了虾肝肠孢虫的虾身上被观察到，更少见的是在实验室中被观察到，但这两种症状并不总是同时出现的。例如，即使虾已经停止产生白色的粪串，池塘仍然可以检测出虾肝肠孢虫阳性，这表明虾肝肠孢虫和白便综合征之间的关联是间接的。相反，也有一些不含虾肝肠孢虫的池塘，呈现白色漂浮粪串，其中含有称为聚集转化微绒毛（ATM）的蠕形结构。此外，众所周知，虾产生白色粪便也可能是其他原因，如严重的格氏菌感染、弧菌病和血细胞性肠炎。因此，观察池塘系统内的白色粪便不能被视为虾肝肠孢虫感染的指标。 通过显微镜检查白色粪便中是否存在虾肝肠孢虫孢子，有助于区分虾肝肠孢虫（EHP）与聚合转换微绒毛（ATM）或簇虫感染。如果没有这些，应进行组织切片的组织学分析，以检查是否有弧菌病和血细胞性肠炎。由于虾肝肠孢虫和白便综合征之间的关系似乎是有条件的，并且由于虾肝肠孢虫的严重感染通常伴随着细菌的增殖，因此有人提出，在严重感染的对虾中，特定细菌的存在可能触发白便综合征。例如，最近一项关于白便综合征虾的宏基因组研究揭示了除了虾肝肠孢虫之外，以前未报告的细菌类型。其中包括厌氧菌，由于正常的做法是利用有氧条件从受感染的虾中分离细菌，这些细菌本来可以逃避检测。在考虑这类细菌可能触发白便综合征的潜在机制时，我们需要考虑观察到严重虾肝肠孢虫感染通常不会以肝胰腺中虾肝肠孢虫原虫产生大量孢子为特征（即在任何一个时期产生活跃孢子的原虫数量通常相对较少）。另一方面，白便综合征虾通常含有大量产孢原虫，且肝胰腺小管上皮细胞明显脱落。基于这些观察，我们假设一个特定的细菌分类群（或“病理生物群落”）能够触发大多数原虫同时产生孢子，导致大量孢子释放，伴随着细胞碎片和大量细菌生长，这在白便综合征虾的大量白色粪便或白色中肠（肠道）内容物中被明显地观察到。 作为预防虾肝肠孢虫的措施，建议虾农确保供应的仔虾（PL）为PCR阴性，并在放养前后采取适当的生物安全措施，以防止环境源的感染。然而，一旦虾肝肠孢虫以任何方式传播扩散到环境中，由于目前缺乏有效或经批准的治疗方法来控制肝胰腺微孢子虫，缓解这种情况就变得非常困难。因此，实际的农场控制策略仍然需要，我们建议这些策略应该基于观察和分子研究信息。本节总结了当前和潜在的研究方向，可以促进虾肝肠孢虫控制策略的发展。 由于虾肝肠孢虫感染涉及孢子出芽，直接干扰虾肝肠孢虫孢子也可能是一种有效的控制策略。例如，与未出芽的孢子相比，在经口插管前在体外出芽的纯化孢子显示出极低的传染性。结果表明，除消毒外，诱导极性管出芽是灭活虾肝肠孢虫孢子的一种可行方法，特别是在有虾肝肠孢虫感染史的池塘或孵化场。pH值对孢子萌发的影响也得到了证实。在pH值为4、7和9的缓冲液中，孢子萌发率分别为5%、10%和90%，说明高pH促进了孢子的出芽。因此，建议在虾池准备期间使用生石灰（CaO）进行底层处理，以在放养前刺激孢子出芽（即灭活），特别是对于先前经历过虾肝肠孢虫感染的池塘。最后，极端温度已经被证明能够杀死虾肝肠孢虫。我们建议活的或新鲜的虾饲料，如多毛类和双壳类，在喂食亲虾之前，应在−20°C下冷冻至少48小时。然而，一个更好的治疗方法是在70°C下保持15分钟（巴氏杀菌），因为这样不仅可以杀死虾肝肠孢虫，还可以杀死虾的其他主要细菌和病毒病原体（如果存在）。巴氏杀菌可能会降低亲虾的无节幼体产量，但我们认为，这一成本是合理的，可以消除这些饲料中病原体污染的高风险。 自2009年正式描述（尽管之前已知），虾肝肠孢虫（EHP）已成为亚洲外来养殖南美白对虾（Penaeus vannamei）最重要的病原体之一，它引起了明显的肝胰腺微孢子虫（HPM）疾病。这与以往人工养殖的斑节对虾中通常隐蔽、低水平感染的历史形成了鲜明对比。虾肝肠孢虫的负面影响的变化是由于寄主转换还是由于饲养方法的不同（例如，与南美白对虾的饲养密度大幅度增加）仍然是个问题。在任何情况下，它都可能出现严重的感染，引起生长迟缓和可能的虚弱，导致机会病原体的继发感染。 综上结论可以看出，与其他主要虾类疾病一样，预防仍然是抵抗虾肝肠孢虫的最佳防线，特别是考虑到目前还没有在规模养殖场进行成本效益高的治疗方案。安鳍公司畅立舒天然植物提取，具有抗菌、抗病毒、驱虫、增强免疫及促进生长的作用，助力绿色健康水产养殖。 畅立舒的应用场景 1、应用于水产养殖过程中由于感染寄生虫病而造成水生动物组织机械损伤、身体瘦弱、生长缓慢时的水质改良。
2、应用于水产养殖过程发生弧菌属、爱德华氏菌属、气单孢菌属和链球菌属感染时的水质改良。 3、应用于水产养殖过程发生水霉属、绵霉属和丝囊霉属感染时的水质改良。
4、适用于提高水生动物机体非特异性或特异性免疫功能，增强机体抗病抗感染能力。 
根据本综述中讨论的相关要点，我们概括了以下指南，如果正确遵循，可以显著降低虾养殖系统中虾肝肠孢虫感染的可能性：a. 活饲料和新鲜饲料，特别是亲虾饲料，应避免一起使用，如果使用，应首先进行巴氏杀菌(理想条件下)或首先冷冻在- 20℃ 48小时(非理想条件下)，以杀死传染性阶段的虾肝肠孢虫。b. 雌性亲虾在被转移到产卵池之前应该被饥饿4-6小时，以减少它们在那里排便的可能性。c. 在N6阶段之前的卵或无节幼体应该用干净的孵化水彻底清洗，以去除可能来自产卵池中的亲虾粪便的虾肝肠孢虫生命阶段。d. 在放养池塘（特别是那些以前受到过虾肝肠孢虫影响的池塘）之前，建议用生石灰（CaO）处理，以刺激孢子发芽和灭活，以降低其感染力。e. 无论是否声称其为虾肝肠孢虫的特异性无病原体（SPF），在引进前应通过PCR对仔虾进行筛选，以确认是否存在虾肝肠孢虫。f. 放养虾肝肠孢虫阴性对虾后，应定期对池塘中的虾进行虾肝肠孢虫检测。g. 如果定期池塘采样检测发现有早期虾肝肠孢虫感染或疑似感染，可以改变池塘管理以减少水平扩散（例如，降低虾密度、增加水交换、清除粪便、移除和掩埋死虾或濒死虾，以防止同类相食）。h. 我们鼓励养虾人评估对虾肝肠孢虫感染的遗传易感性变异的可能性。农民应寻求适当技术专家的帮助，以协助定期监测，使用适当的诊断工具和测序技术，以区别虾肝肠孢子虫与其他肠细胞动物群微孢子虫（和非肠细胞动物群微孢子虫）。Thawatchai Chaijarasphong, Natthinee Munkongwongsiri, Grant D Stentiford , Diva J Aldama-Cano, Kwanta Thansa, Timothy W Flegel, Kallaya Sritunyalucksana, Ornchuma Itsathitphaisarn. The shrimp microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei (EHP): Biology, pathology, diagnostics and control. J Invertebr Pathol. 2020 Sep1; 107458. doi:10.1016/j.jip.2020.107458. 
图1. 虾肝肠孢虫孢子横切面和纵切面的电子显微照片，显示有5-6圈的极性管（箭头所示）。
图2. 虾肝肠孢虫的生命周期和传播路径的示意图。 生命周期中的阶段包括： （1）孢子出芽，孢子通过极性管刺穿目标寄主细胞膜，将内含物转移到细胞质中。 （2） 孢子体经过核分裂产生分枝的原虫。 （3） 孢子出芽前体在原虫内部形成。 （4） 原虫分裂产生孢子母细胞。 （5） 宿主细胞破裂释放成熟孢子。 虾肝肠孢虫可通过粪便和同类相食行为进行传播。作为虾肝肠孢虫携带者的替代宿主也可能存在，但这种可能性尚未得到实验证实。这条传播途径，暗含着这一事实。 
图3. 在虾肝肠孢虫感染的雄性虾中H＆E和ISH测试结果的显微照片示例，显示即使肝胰腺感染严重，睾丸对虾肝肠孢虫也没有出现阳性ISH测试结果（即深色ISH信号）。使用雌虾也可获得类似结果。 
图4. 肝胰腺组织的压片或涂片中的虾肝肠孢虫孢子和原虫。
在壁球架上，由于在蒸馏水中进行准备，细胞会膨胀。 （a） 单个肝胰腺小管上皮细胞的图示，显示虾肝肠孢虫原虫在宿主细胞核周围的细胞质中的分支特性。 （b） 两张用福禄辛B染色的轻度压扁的肝胰腺细胞的显微照片，显示分枝的原虫和宿主细胞核。 （c） 显微镜图显示增厚的原虫(难以区分分支)。 （d）显微照片：H＆E染色的肝胰腺涂片，显示来自破裂的上皮细胞的虾肝肠孢虫孢子簇。 （e），（f）两张用H＆E染色的肝胰腺涂片的显微照片，显示虾肝肠孢虫原虫和孢子。 
图5. 虾肝肠孢虫在4μm石蜡切片和半薄环氧切片中的显微照片。 （a） 肝胰腺组织的H&E染色石蜡切片显示孢子和原虫。 （b） 甲苯胺蓝染色半薄切片显示孢子和原虫。 
图6. 透射电子显微照片显示了一个原虫孢子前发育阶段，包含多个细胞核，被电子密度高的新生极性细丝包围。将这个原虫的细胞核与图4b中放大倍数低得多的点状核进行比较。 
图7. 用色谱法对虾肝肠孢虫感染的肝胰腺组织的显微照片进行染色，以显示虾肝肠孢虫孢子，并与ISH染色的相邻组织切片进行对比，以便于检测虾肝肠孢虫感染细胞是否产孢。左栏显示同一组织切片的低倍和高倍显微照片，而右栏显示经ISH染色的相似相邻组织切片的显微照片。单靠估计严重程度的孢子就可以清楚地显示出虾肝肠孢虫的严重性。第一张染色显微照片顶部的三个环抱孢子群与放大倍数较高的显微照片中圈出的孢子群相同。 
图8. 正常与严重感染虾肝肠孢虫的肝胰腺组织的显微照片对比显示白粪综合征。 （a）正常肝胰腺组织 （b）肝胰腺组织显示肝胰腺小管上皮适度变薄，小管管腔内有一些脱落细胞（箭头所示）。 （c）肝胰腺组织，小管上皮严重变薄，小管腔内脱落细胞较多（箭头所示）。 
图9. 从白粪综合征虾的肝胰腺组织和白色粪便的涂片的显微照片显示虾肝肠孢虫孢子与细菌混合感染。 （a） 涂片显示虾肝肠孢虫孢子（白色箭头）和混合感染细菌（黑色箭头）的肝胰腺组织。 （b） 从虾中肠的白色粪便涂片显示出虾肝肠孢虫孢子（白色箭头）和混合感染的细菌（黑色箭头）。 
图10. 用幼虾标本进行ISH试验中，感染虾肝肠孢虫的肝胰腺组织的低倍显微照片。通过常规的H&E染色，正常组织学分析表明，样本中产生孢子的细胞相对较少。尽管如此，在肝胰腺的中央和中部，有很高比例的小管上皮细胞对虾肝肠孢虫的存在是阳性的（暗染色），而在远端E细胞区则呈阴性染色结果。此外，感染细胞在肝胰腺中的分布是不均匀的，因此从肝胰腺不同区域随机抽取的小样本，对虾肝肠孢虫感染严重程度的定量PCR结果有很大差异。
图11. 在pH值为4、7和9的缓冲液中纯化虾肝肠孢虫孢子出芽率图。出芽率在pH值为9时最高。 表1. 比较各种诊断方法的敏感性、特异性、可性性和定量能力。每个方面都以字母A-D排列（A=最佳；D=最差）。
表2. 用于检测虾肝肠孢虫的各种分子方法的引物。
本文由龙岩学院生命科学学院王鑫翻译与整理。
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