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本文介绍了功能近红外光谱(functional near-infrared spectroscopy, fNIRS)在技术、实验和分析软件方面的实用入门知识，目的是启发感兴趣的从业者考虑使用一种无创、多用途，但具有挑战性的研究大脑的途径（光学方法）。本文首先简要概述了相关的解剖学和光学基础，并讲述了一个简短的发展历程。并且描述了不同类型的光照 (透射、反射和差分反射)和数据采集方法(连续波、时域和频域)，介绍了fNIRS系统的基本部件(光源、探测器和记录部件)，给出了fNIRS技术的优点和局限性，随后以fNIRS进行的各种实验和临床研究为例，提出了非常实用的使用建议，为许多大脑相关疾病的研究提供了启发。最后，本文描述并讨论了一些适用于数据分析和结果呈现的免费工具包。综上所述，本文推荐使用fNIRS，是因为其不断增多的临床应用、最先进的神经成像技术以及可管理的硬件要求。可以有把握地说，fNIRS的广泛用途和低成本，为神经医学检查的箭筒增添了一支新的箭矢。本文发表在IEEE REVIEWS IN BIOMEDICAL ENGINEERING杂志。（可添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文及补充材料）。思影曾做过多期关于近红外脑功能研究的文章解读，如果您感兴趣，可结合阅读（红色为我个人比较推荐的文章）： Science advances：新生儿的言语知觉 JCCP:亲子神经同步:一种阐明学龄前儿童应激性双向相关 日常复杂动作的语言和运动表征：一项fNIRS研究 The Neuroscientist：是什么引导我们在神经和行为上与特定的 PNAS：近红外研究：产前农药暴露的青少年的大脑激活情况 fNIRS在认知神经科学中的应用现状和未来 近红外脑功能机器学习：易激惹性独特地预测了学前儿童的抑 对前语言期婴儿心理理论相关的颞顶联合区的近红外研究 fNIRS：3-8个月大的婴儿面孔加工研究 眼动追踪与近红外结合:婴儿利他行为的神经发育基础 fNIRS超扫描：亲子互动中的脑同步及其与情绪的关系研究 FNIRS研究：额颞叶-顶叶系统在真实情景下目光接触中的脑内和脑间 HBM:阅读中语音产生期间的脑功能近红外光谱研究 大话脑成像之四--浅谈近红外脑功能成像 FNIRS研究：陌生气味竟可以引发新生儿的疼痛感受 PNAS近红外研究：跨感觉通道可塑性促进人工耳蜗的移植效果 PNAS:婴儿早期记忆能力比我们想象的要高 毫无疑问，大脑是人类已知的最复杂的结构之一，因为它有大量的神经元，其皮层神经元细胞的数目大约是胶质细胞的4倍，形成了1014个突触连接。因此，了解人脑的内部的工作机制和功能是当今时代最深刻、最深远的挑战之一。这种对理解的追求，有助于促进脑疾病新治疗方法的形成、大脑功能的基本发现，以及从神经医学、实时大脑监控到新的通讯设备的有效应用。遗憾的是，这个进程十分缓慢，并且存在许多未决的问题，尤其是因为缺乏高分辨率的快速测量系统。这导致了大脑研究工作的过度简化。例如，把大脑简单地看成是神经元的集合，而忽略了胶质细胞和血液供应在大脑中的基本作用，这是非常普遍的误解。据估计，几乎每个神经元都有自己滋养的毛细血管，总共构成了400英里长的基础供应链。 由于神经元自身不能维持任何大量氧气或葡萄糖的供应，由于计算量的增加而带来的神经活动增强必然伴随着血管供血量的增加，这最有可能是由神经元自身的化学信号触发的。然而，局部神经活动与由此产生的脑血流动力学适应之间的真正关系，称为神经血管耦联(neurovascular coupling, NVC )，尚未被完全理解。大多数对NVC的研究使用昂贵、体积庞大、时间分辨率有限的固定功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）设备。尽管fMRI提供了优越的空间分辨率，但其高成本、低时间分辨率和有限的移动性是许多研究者面临的挑战。 幸运的是，随着功能近红外光谱( functional near infrared spectroscopy, fNIRS )系统的出现，这种情况可能会有所改善，因为fNIRS系统是一种方便且成本较低脑血流动力学的成像方式。与fMRI的标志性BOLD [Blood-Oxygen-Level Dependent（血氧水平依赖）]信号类似，fNIRS数据也依赖于NVC。然而，与fMRI信号相比，fNIRS空间分辨率有限。正如名称所指出的那样，fNIRS利用波长在750 nm ~ 1200 nm范围内大于可见光的近红外光，这种低能量辐射得益于组织的特殊光学特性。 有不同的脑成像技术可以测量组织的物理或化学性质的变化，包括在大脑活动期间，然后根据组织性质的先验知识，测量技术的原理，将这些变化转化为反映大脑活动变化的数据。 fMRI的BOLD信号是利用神经活动过程中血液磁化率的变化来测量大脑活动的变化，另一方面，fNIRS通道监测神经活动期间组织光学特性的变化，主要是血液的吸光度，来测量这种活动。近红外光谱系统使用近红外范围内的光来达到这个目的，因此，了解光的传播原理和组织的光学特性助于fNIRS的研究人员控制红外光谱系统。光的传播取决于光的波长和介质的光学性质，这些性质决定了入射光的反射、散射和吸收。其中，吸收取决于介质的化学组成，散射(被认为是偏离直线轨迹)受许多参数的影响，如波长和颗粒浓度，反射取决于光与组织的入射角，以及材料的光密度。 被吸收的光在吸收介质中以热的形式散去，介质的分子构成决定了最大吸收发生时的特定波长。健康灌注组织中最重要的生色团或吸收特定波长光的化学基团是含氧血红蛋白HbO2，脱氧血红蛋白Hb，它们的总血红蛋白HbT和细胞色素c氧化酶。这些蛋白浓度随着时间和氧气浓度的变化而变化。近红外光在生物组织中具有良好的传播特性，因水或组织中相关色团对其吸收有限，而1200纳米以上的光主要被组织的水分所吸收。 吸收量由摩尔消光系数a作为波长的函数来量化，其表示了生色团（生色团的具体解释：https://baike.baidu.com/item/%E7%94%9F%E8%89%B2%E5%9B%A2）在那个波长吸收光的程度，这导致每个生色团都有独特的吸收光谱。显著的细胞色素c氧化酶(图1中Caa3 )不能作为组织氧合的指标，因为它是代表细胞内氧合的线粒体酶，其浓度依赖于氧变化以外的因素。相反，Hb和HbO2浓度是组织监测的主要关注点。 将从体表收集到的近红外光子转换为组织激活信息的计算依赖于这些被通过组织的光学特性。下面将介绍其中的一些光学性质，并描述如何推导近红外光子通过组织的扩散路径，以及如何利用这些性质来估计Hb和HbO2的浓度变化。 由于吸收和散射都会对光造成衰减，因此在NIRS中应同时考虑这两个参数。比尔-朗伯定律将光的吸收衰减与生色团浓度联系起来:
入射光的衰减A由接收光强度( I )与光源光强度( Io )的对数比值定义，等于摩尔消光系数a、摩尔生色团浓度c和光源与探测器的距离d的乘积。光衰减的第二个主要因素是散射，在没有大量能量损失的情况下，光子的运动轨迹是通过与物质相互作用而改变的。散射是光在生物组织中传播的主要机制。米氏散射(散射体的维数与入射波长相似)是弱波长相关的。人体头部由许多不同的层组成，具有独特的密度和厚度，从而产生了许多不同的近红外光散射路径。因此，在模拟中必须仔细考虑皮肤、骨骼和脑质。 光子穿过含有均匀分布相同散射体的介质时，在距离z上可能以概率Ps ( z )散射，远离其直通道。这个概率由它的散射系数µs，即光子所能覆盖的距离的倒数(1/cm)来描述。µs的倒数可以解释为散射自由平均路径长度mfps，或者光子在散射事件之前的平均距离。
图1. Hb、HbO2、H2O等生色团在近红外范围内的吸收光谱。HB/HbO2吸收光谱的等渗点在近红外光学窗口内以白色圈出。 为了修正组织的各向异性散射特性，必须将µs修正约化散射系数µ’s，其考虑了各向异性因子g：
脑灰质和脑白质在760 nm和830 nm波长处的典型约化散射系数分别为11.81 / cm和11.11 / cm，这一般被用于fNIRS。由于NIR光光子在体内组织中受到的散射大于吸收，故其通过体内的扩散可以描述(并模拟)为步长为1 / µ s′[cm]的随机游走。 由于光子走的不是从光源到探测器的直线距离，而是沿着一条随机的路径走了大于d的距离，因此需要引入了增加的真实路径距离作为差分路径长度(differential path length, DP)。为修正Beer- Lambert定律，引入差分路径长度因子(differential path length factor, DPF)如下:
在上式中，由于未知项G，入射光的衰减与消光系数不成线性关系，G包含了光路形状和散射因素的影响。因此，用此公式无法计算出准确的生色团浓度。但是，如果假设G对所有生色团都是常数，就有可能从方程中剔除G，从而计算生色团浓度的变化。这么做的前提假设是d和DPF在实验时间段内是常数。 图1描述了700 ~ 950 nm之间的近红外吸光度“甜点区间”(最合适的区间），Hb和HbO2光谱在805 nm左右的等渗点相交。方程中的未知数可以通过求解等渗点两侧两个(或多个)测量波长的比尔朗伯定律公式来消除。这有助于发现Hb和HbO2浓度的变化，因为两个波长的衰减变化都很小：
其中，L为总平均路径长度总平均路径长度d *DPF，a为各自的消光系数，[HbX]为各自的浓度，其解为：
额外的波长可用于测量其他生色团的浓度，如细胞色素c氧化酶和水，或者用于提高Hb和HbO2浓度测量的准确性。通过引入上面的假设，可以使用这些方程进行计算得到误差最小的近红外波长。如果您对近红外脑功能及其他心理认知研究数据处理感兴趣，欢迎浏览思影科技课程及服务（可添加微信号siyingyxf或18983979082咨询）：第二十五届脑电数据处理中级班（上海，3.17-22） 第二十六届脑电数据处理中级班（重庆，4.9-14) Glenn Millikan在20世纪40年代尝试测量灌注良好的肌肉中的氧浓度(用Oxometer)被认为是光学传感方法的起源。1977年Frans Jobsis提出了他的第一个尝试：用透光光谱法测量猫大脑中的血氧水平及其变化。他解释了脑组织对NIR光的相对透明度，论证了利用NIRS监测脑Hb氧合变化的可行性。这些实验和他随后的研究使他成为体内近红外光谱的奠基人。 20世纪80年代，Marco Ferrari开始在动物身上测量脑氧合及其变化，他的研究结果进一步证实了近红外光可以有效检测血液氧合变化。1985年，Ferrari进行了实验，使用定制的近红外光谱系统监测成人血液氧合变化。这些实验以及Brazy等人 (包括Jobsis)监测早产儿脑氧合的实验标志着近红外光谱首次成功应用于人类患者。1986年，Ferrari等人对新生儿和脑血管患者进行了更多的脑血管测量，其数据显示了颈动脉压迫对局部脑血容量和氧合的影响。与此同时，David Delpy等人(包括M Cope)首次从患病婴儿的脑血中收集了HbO2、Hb和HbT变化的定量数据，他们使用了一个定制的四波长跨光近红外系统来监测氧合水平的变化。他们的发现为近红外光谱作为临床脑氧合监测仪打通了道路。他们在1988年的实验提供了不同近红外波长的血红蛋白吸收光谱，便于量化从大脑收集的近红外数据，并估计能够通过大鼠大脑的近红外光的光程长度。他们还介绍了所用的系统——1989年由滨松光电公司生产的第一个商用近红外光谱系统的基础设计。 Duncan等人使用相位分辨光谱法从100年成人和35个新生儿的头部收集到精确的差分路径长度因子(DPF)值,即绝对路径长度除以光源和探测器之间的距离。Deply等人延续了他们的工作，使用传播时间测量法准确计算出近红外光子的光学路径长度。他们的发现表明了婴儿和成人之间，男性和女性之间，以及不同波长之间存在差异。直到1993年，第一个人类近红外光谱系统（单通道）的测量结果才被公布。Hoshi的数据显示，在认知任务(解决一个算术问题)的大脑激活过程中，相关区域的HbO2增加，Hb减少。这种变化与脑血流量的增加有关，而且年幼被试比成年人更为显著。Chance等人将在一个相对有限的光照组织(香蕉形状)中血氧浓度的变化解释为在类似的认知任务(问题解决)中脑激活的度量。他们得出的结论是，近红外光谱可以监测局部的大脑活动。
图2. 年表罗列了一些对fNIRS的完善有贡献的早期的实验和发展 1993年，Villringer等人使用NIRS来评估认知任务和视觉刺激过程中大脑的血流动力学变化。他们的结果表明，NIRS确实可以记录大脑活动的变化，而不仅仅是皮肤的血流动力学变化。Kato等人研究了HbO2和Hb在视觉刺激过程中的变化。Okada等人(包括Hoshi和Tamura)记录了由于惯用手和性别而产生的差异，他们还在1997年发表了fNIRS在精神分裂症患者中的首次临床应用。 Gratton等人测试了用NIRS进行光学扫描的可行性。他们率先为证明了大脑的光学特性变化与神经元活动之间的间接关系提供了证据。他们通过证明强光源照射的近红外光与生色团之间的相互作用，证明了在反射模式下测量的可行性。这种相互作用发生在光线穿过组织的长而随机的路径上。这些工作支持了第一个多通道fNIRS系统的出现。 目前，fNIRS是一种非常有用的神经成像技术，因为它拥有比fMRI或PET更低的成本和更好的便携性。它已经在临床和研究环境中树立了自己的地位，即监测与视觉、听觉、语言、运动任务、学习和情绪刺激相关的大脑功能。 近红外信号与区域脑血流量相关，因此可以经济有效地增强PET或fMRI的BOLD信号测量效力。他们可以共同阐明血液动力学反应与神经元活动的耦合，正如脑电图(electroencephalography, EEG)所揭示的。 NIRS的表现受惯用手和性别的影响，同时也特别受头皮组织光学特性的变化和大脑激活减弱而导致的衰老的影响。 fNIRS的普及得益于其便携性、适中的空间和时间分辨率、易用性以及扫描缓慢移动的被试的能力。所有这些优点使研究人员能够单独使用它，或者与fMRI等其他测量手段一起使用。Ⅳ. 不同类型的NIRS 
NIRS系统主要分为三种类型：I）连续波光谱系统（Continuous Wave, CW），II）时域光谱系统和III）频域光谱系统（如图三所示）。每一种系统都有其优缺点，研究人员必须根据系统特性设计实验：·连续波NIRS：CW-NIRS是最古老，使用最广泛的商用NIRS系统。这种类型的设备使用多个波长的光源以及光电二极管或光电探测器测量光的衰减。缺点：无法将吸收和散射造成的衰减区分开来；通常受光源-探测器距离（sourcedetector distance, SDD）限制，某些系统的光穿透深度较小。·时域NIRS：通常使用固态激光器提供短暂的强脉冲。光衰减是通过非常敏感的特殊记录仪或单光子计数器通过对光子到达时间排序来进行测量。·频域NIRS：LED、激光二极管或白光源提供输入光。该系统可测量出射光相对于入射光的衰减，相移和调制深度。它利用光程长度与频率（< 200Mhz）相移之间的线性关系，使用增益可调面积检测器或光子计数设备进行测量。Ⅴ. NIRS光照模式（图4） 
图4. 不同NIRS的工作模式：透射照明、反射率和差异反射率。1）透照：由于头皮组织的光学特性随年龄的增长和头部尺寸的增加而发生变化，该模式只适用于新生儿，并不用于成人。2）反射：大多数当前的NIRS设备中都采用了这种模式。在反射模式下，NIRS的穿透深度约为SDD(光源-探测器距离)的1/3左右。3）差分反射：使用多个NIR探测器（或光源）测量颅内外光路之间的差异。3）组织光学特性系数的准确性和用于计算HbO2和Hb的模型。 在以前，NIRS的穿透深度被限制在颅骨下3毫米以内。当前的仪器能够使光到达1-2 cm的深度，通常认为增加SDD(光源-探测器距离)会增加穿透深度，这取决于几个因素，包括近红外光的辐射能量、头部的光学特性、SDD以及探测器的面积。虽然增加SDD能够增加穿透深度，但数据质量会随着SDD的增加而变差。 因此，近红外系统通常采用2-4cm之间的SDD。在具有较长的SDD情况下，探测器太小会导致DPF不稳定。故必须选择与SDD适配的探测器。目前设备的研究致力于提高光源和探测器的保真度，以满足零光源-探测器距离(0SD)的时间精度，从而改善血流动力学响应的定位。NIR光源：大多数情况下，光源是发光二极管（LED）或激光二极管。出于安全考虑，通常首选LED。皮秒激光器常用于实验性的0SD系统。NIR探测器：光电二极管、雪崩光电二极管或光电倍增管（photomultiplier tubesPMT）通常用作NIRS探测器。它们表现出低波长选择性，因此必须注意避免环境光的影响。控制和数据收集电子设备：NIRS光源和探测器必须由复杂的电子电路控制。由NIRS探测器收集的数据被放大并保存在此硬件上，或者数据线或无线传输到另一个电子电路或计算机，在那里进行进一步的放大、降噪并进行信号分析。NIR光传输模块：NIR光直接从NIR光源照射或通过光纤传输到头皮。反射的NIR光由探测器直接从头部接收或通过光纤接收。便携、低功耗和低成本：16通道（16个光源和2个探测器）的NIRS设备只需要一个3.6V-1000mAH的电源即可驱动。fNIRS设备可设计为便携式的，以供自由移动的被试使用。NIRS也可以在床边，紧急情况下或在救护车中使用。此外，基本fNIRS的成本远低于MRI。无创性和安全性：LED甚至激光二极管均可以保持低温，避免造成皮肤的疼痛或热损伤。易于佩戴和设置：无需特殊的皮肤粘合剂即可将光极连接到头皮。大多数情况下，光极是可重复使用且可以进行长时间测量。此外，使用后的光极清洁也非常容易，但是这也取决于制造商。运动伪影：与使用光纤的fNIRS系统相比，运动伪影在最小化的fNIRS系统中也不那么明显，因为fNIRS系统的光电耦合器和控制电路距离很近，并且两者都连接在身体上。在剧烈运动时，光纤可能会移位，从而影响光耦合。信噪比和时空分辨率：就时间分辨率而言，fNIRS的时间分辨率明显高于fMRI，但略低于EEG。而fNIRS 的空间分辨率虽只略低于EEG，却远远低于fMRI。fNIRS中的信噪比（signal to noise ratio，SNR）比fMRI弱。另外，有研究发现，fNIRS的SNR虽比fMRI弱，但两者信号高度相关。
图5. fNIRS（蓝色）、EEG（红色）、fMRI（黄色）、PET（紫色）和MEG（绿色）的多种参数的比较。（a）深度分辨率，与神经活动的关系，侵入性，时间分辨率，空间分辨率，预估系统成本和运行成本。 （b）操作、尺寸、头部固定装置、长期研究的容易程度、被试的移动能力、环境、安全性和便携性。 在特殊人群中的应用：fNIRS 适用于一些特殊人群，如植入设备的患者、有幽闭恐惧症的患者等。响应与fMRI的可比性：有学者同时记录了事件相关视觉刺激的近红外和功能磁共振成像，并测量了响应峰值振幅在被试间对的变异系数（coefficients of variation, CVs），发现NIRS的CVs比fMRI大得多。而响应潜伏期在被试间和被试内的CVs对于二者来说具有可比性。 由于光传输模块的传感器和皮肤或玻璃纤维和皮肤之间总是有很小的气隙，避免环境光影响测量是具有挑战性的。因此，在头上以适当的角度放置光极以发送和接收光是重要的。 fNIRS不能穿透大脑的较深区域，它在皮质中的穿透深度约为1-3 cm。因此，无法通过简单的fNIRS装置来测量来自深层大脑结构的血液动力学响应。 尽管fNIRS的采样比fMRI更快，但它的时间分辨率低于EEG。因此，在脑机接口(brain-computer interfaces, BCI)等应用中使用fNIRS需要更长的任务周期。然而，它可能不足以监测到大脑区域之间的活动延迟。 与fMRI的毫米体素大小相比，fNIRS的空间分辨率相当有限，约为1cm。即使把光源和传感器之间的光路简化成“香蕉形”，也很难谈论单个通道的“空间分辨率”，因为吸收是以一种整合的方式在每个单个光子的路径上起作用。 fNIRS在带宽较小的情况下产生有噪声的信道。由于fNIRS是一种光学方法，感兴趣区域（region of interest, ROI）存在的头发（尤其是深色头发）可能会阻挡光线并降低进入和离开头骨的信号强度。实验前可能需要较长的准备时间，以确保光镜下的毛发最少。因此，实验前准备时间和信号强度取决于ROI。尽管信号不受身体运动产生的肌肉伪影的影响，但信号质量仍可能受到头部运动的负面影响，这可能会引起光传输效率的波动。此外，呼吸振荡(0.2-0.5 Hz)、心跳伪影(1-1.5 Hz)和颅外活动都会被包含在NIRS数据中，在某些情况下，这些因素可能会对数据的准确性产生很大的影响。 将玻璃纤维或led的工作端压入皮肤，是一种减少环境光伪影、简化光电器件放置和优化光传输模块耦合的简单方法。然而，这在一段时间后会使被试感到不舒服，引起压力或头痛，从而影响实验采集。弹簧式光极：fNIRS光极和帽子的挑战之一是处理头发。如图6（a）和（b）所示，已经开发并应用了一种弹簧式光极，以实现：
图6. 作者的弹簧式的fNIRS示例（a）光源，（b）探测器和（c）光极分布和类似的EEG通道分布示例。 已有研究表明，环境光对fNIRS的性能有重要影响。通常，最好使用深色盖子将光极与周围的光线隔离开。除此之外，fNIRS帽上还覆盖了一个黑色的盖，也可以进一步减少环境光的影响。同时，也可使用特殊的帽子和/或辅助帽等来固定光极以最大程度地减少环境光和运动伪影。 长期使用fNIRS可能会使得光源和头皮接触点的温度升高。通常来说，商用fNIRS系统必须通过安全或法规标准。尽管如此，在使用激光光源时，仍需注意防止眼睛或皮肤受伤。在进行研究时，应就使用的fNIRS设备的安全极限与被试进行沟通。实验室设计的fNIRS系统必须满足IEC80601-2-71：2015的要求，即它们的设计必须遵循fNIRS设备的基本安全和基本性能。 为减少脑外或浅表的影响，可采用不同SDD的光电器件。从短SDD收集到的数据将呈现浅表活动(如图7)，然后通过适当的建模，可以将其从更深层次的大脑活动中分离出来。对于具有弱/极端噪声信号的通道，可进行适当的滤波、降噪和信道抑制。
fNIRS是一种十分成熟的技术，并且其应用领域在不断扩大。它的应用都是基于大脑在各种条件和研究范式下的血流动力学响应，这也说明了在某些情况下fNIRS技术有取代更昂贵的固定成像模式的可能性。因此，它已经被应用于功能连接、认知神经科学以及神经诊断或康复和神经影像学等方面。表1列出了关于fNIRS应用的部分文献。
无论使用什么fNIRS硬件进行实验，fNIRS数据的处理和分析都是研究工作的重要组成部分。究竟什么样的分析软件能够有助于数据的处理与分析，加速研究进展，研究人员在选择时需要考虑以下因素：d）软件语言可能加速或阻碍对软件的理解，这取决于研究人员的经验；
图8.使用不同软件进行的NIRS数据可视化和分析。（a）使用HOMER2进行大脑激活的2D可视化，（b）大脑激活的2D可视化，（c）NIRS数据滤波，（d）使用NIRSlab进行血氧变化计算。 尽管近红外光谱技术已经建立并广泛应用于农业、医药或纺织产品的无损检测，但其更令人兴奋的应用在于它能够提供一个了解人脑加工的多功能窗口。fNIRS技术的一系列发展使得它已经在医学和科学领域得到了广泛的应用。由于它的多功能性和对人类大脑皮层的覆盖率的增加，fNIRS也已经被应用到基础神经科学领域，用于揭示大脑皮层中最重要的激活模式和连接。最近，人们更热衷于将fNIRS与EEG和fMRI等其他方法结合起来，以实现从验证到数据融合再到BCI的目标。近十年来商用fNIRS系统的数量在迅速增长，可以看出fNIRS的未来是光明的。然而，若将它真正的应用到临床或紧急医疗中，信号保真度，传感器和分析方法都需要进一步改进。
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