利用同源重组进行基因敲除的原理你真的知道吗？

基因敲除是生物领域开展研究的重要手段，而同源重组是最经典、应用非常广泛的一种敲除方法。顾名思义，同源重组就是利用同源片段将目的基因截短、删除或者替换，使基因失活从而实现敲除的目的。

这里，以细菌为例，介绍用敲除质粒将基因截短的原理，过程可以分为两大部分：单交换（发生一次交换）和双交换（发生两次交换）。

这里用蓝色表示基因组，将要敲除的目的基因分成三段：A、B、C。B是要截去的片段（有时可能基因较短，选取时可以延伸到基因上下游间区）；用黄色表示构建好的敲除质粒，A和C我们称为上、下游同源臂，将目的基因的B段敲除，利用的就是质粒和基因组的A、C同源臂发生同源重组（至于为什么需要两个同源臂，看完整个过程你就会明白啦）。

因为有两个同源臂，所以单交换的发生有两种情况，即发生在A，或发生在C。在这里，我们先列出一种情况——发生在A，让我们把目光聚焦到A上：

敲黑板划重点！

同源重组是发生在两段同源序列上（同源说简单点就是相似度很高，体现在这里就是正义链和正义链，反义链和反义链），所以过程中图里的5’和3’端大家一定要看好啦。

此A牵起彼A的手说：初次见面请多关照啊~

从平面图来看，就是将下半部分像拧麻花一样逆时针拧一下，形成了“井”字，即Holiday结构。

Holiday结构有两种拆分方式：

左图即质粒成功整合到基因组，发生单交换。

在此单交换的基础上，同源臂再次发生重组，有两种情况——在同源臂A发生重组、在同源臂C发生重组。

为了方便大家看，把单交换横过来：

交换过后前端来自质粒的A用黄色表示，前端来自基因组的A用蓝色表示：

接下来又要开始找朋友啦~

贼开心

为什么会扭成这个样子？

因为两段同源的序列才会发生重组（友情提示：上一个图中外侧两条链是同源，同样，内侧两条链也是）。

接下来的交换过程和单交换是一样的：

拆分结果显而易见，左图基因组上的基因还是ABC，并没有截短，右图还是单交换的状态，所以，单交换发生在A，双交换也发生在A是不能成功敲除目的基因的。

那么，双交换发生在C呢？

让我们把目光聚焦到C上：

黄色表示质粒上的C，蓝色表示基因组上的C。接下来的过程和双交换发生在A是一样的：

可以看到，左图基因组上的基因变成了AC，说明敲除成功；右图仍然保持单交换状态。

总结

如果单交换发生在A，双交换只有发生在C，才能达到敲除的目的；同样，如果单交换发生在C，那么双交换发生在A，基因才能敲除成功哦~ 说到这里，大家知道为什么要设计上下游两个同源臂了吧！

当然，敲除质粒是多种多样的，一般都带有抗性等一些筛选标记以便筛选出单交换，也同时会有些致死基因在筛选双交换的时候起作用；同样，替换的原理跟截短是一样的，万变不离其宗。