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蛋白质印迹过程涉及多个步骤，包括样品制备，样品上样，电泳，蛋白质转膜，抗体孵育和信号检测。内参的选择和使用对蛋白印迹实验结果的可靠性起着决定性的作用。 1) 内参的上样考虑了以下几个方面的潜在变化： 2) 每个泳道中上样的蛋白质量； 3) 不同样品/泳道之间从凝胶到膜的蛋白质转移效率； 4) 抗体孵育(针对一抗或二抗)以及跨单独样本/通道的信号检测； 5) 内参对照蛋白的信号也通常用于归一化目标蛋白的信号。 为了实现内参蛋白的这些实验目的，在实验开展的时候需要让内参抗体蛋白和实验抗体蛋白在同一印迹上进行检测。 内参蛋白有多种多样的选择，对于不同特性的蛋白印迹，需要做出合适的选择，从中找到可以筛选出目标蛋白中得以稳定表达的蛋白。一般会使用组成型表达且是细胞基本功能必需的管家基因作为内参蛋白。通过查阅文献来选择实验潜在的内参蛋白是一个非常有效的办法。 一个蛋白是否能够作为内参蛋白使用需要符合这样几个标准： 1) 在测试条件下，内参蛋白质的水平保持恒定(相对于总蛋白质含量)； 内参蛋白的检测带不得干扰目标蛋白质的检测带及目标蛋白感兴趣的分子(即它们应该具有明显不同的分子量)； 2) 内参蛋白和目标蛋白的检测限在动态范围内。也就是说，实验方案和检测方法可以揭示内参蛋白和目标蛋白水平的变化，而不会出现信号饱和； 3) 内参蛋白的动态检测范围可以通过连续稀释用于蛋白质对照的蛋白质印迹法来确定。信号强度必须与将在实验中使用的蛋白浓度直接相关。 |
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