【原】AKTA蛋白纯化质粒pDNA提取(大通量，更适用于生产）

上海精瑞科学 2021-03-25

展开全文

BIA Separations超螺旋 pDNA 生产（上海精瑞科学）

BIA Separations CIM® 整体柱涵盖了pDNA生产的研发、分析和生产规模的全过程，可提供完美解决方案。您可以生产高纯度的超螺旋（sc）形式的pDNA，并通过对生产过程中不同步骤的实时在线监测来确保批次间的高重复性。此外，CIM®整体柱的高动态结合能力（高达9 mg / mL）和高流速可达到传统色谱方法无法比拟的高生产率。与传统方法相比，CIM®整体柱以更低的成本提高生产效率，更适合满足提高基因治疗产品纯度的要求。灵活性是我们在流程中构建的关键要素。 DEAE和C4 HLD色谱柱可用于实验室到生产，但DEAE色谱柱可单独用于实验室规模或纯度要求较低时使用。也可使用CIMac™pDNA分析色谱柱。

CIMmultus™ HiP² Plasmid Process Pack™ 生产 ( 可在3.5 h内完成）

整个过程的结果表明，处理时间极短（33 minutes/mg pDNA），产率超过80％，sc pDNA的纯度超过FDA / EMEA要求

接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的，基于对流相互作用介质（CIM）层析整体柱的两步质粒 DNA（pDNA）纯化平台！
该方法除了具有以上全部优点，并且可以明显降低纯化时间，提高生产效率，使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。

该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。

首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液

1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：

这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。

操作建议：

先收集菌体；
然后采用碱性裂解法制备原料；

再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。

2. 裂解液浓缩：

氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质

裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。

在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。

TIPS:

1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;

2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;

3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;

4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;

5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。

（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。

第一步纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；

第二步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。

AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。

随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。

层析条件

Monolithic column:	CIMmultus™ DEAE(2 µm)*1
Mobile phase:	Equilibration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
	Washing buffer A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M NaCl, pH 7.2
	Elution buffer A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性，使用的层析设备和色谱柱尺寸)

*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。

层析方法

1. 用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2. 将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3. 将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4. 将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5. 用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6. 用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7. 用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线

在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。

该步骤进一步去除了杂质。

层析条件

Monolithic column:	CIMmultus™ C4 HLD (2 µm)*2
Mobile phase:	Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4
	Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2
	Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸)