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一、导读 宿主肠道拥有复杂的微生物群，其初始源自母代（体），并通过摄食及与其他环境因素的接触而继续发展。人类幼儿在大约3岁时，其肠道菌群会渐趋于成人的菌群组成特点，变得相当稳定。许多因素都会影响肠道菌群，诸如宿主的遗传，饮食及病理状态等。同一物种其菌群组成趋于相同，但不同物种间菌群大相径庭。在交互肠道菌群移植实验中，移植后的无菌斑马鱼及无菌小鼠的肠道菌群与其同类更为相似，这表明宿主拥有让特定菌群选择性定殖的机制。因为肠道菌群在宿主的代谢、免疫及疾病中都扮演重要角色，故阐明宿主调控菌群的机制与方式显得尤为重要。 miRNA是一类小的非编码RNA，大约长度为18-23nt，在细胞核中合成，细胞质中发挥功能。然而，越来越多的证据表明miRNA也出现在胞外并随体液而流动散播。先前的研究已经发现粪便中的miRNA可以作为肠道肿瘤的分子标志物。但正常的肠道中是否拥有miRNA还未探明。本文在肠内容物及粪便中发现miRNA，并且阐明其在调控宿主菌群的角色。 二、论文ID 原名：The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA 译名：宿主通过粪便中的microRNA塑造肠道菌群 期刊：Cell Host＆Microbe IF：14.946 发表时间：2016年1月 通讯作者：Howard L. Weiner 通讯作者单位：哈佛医学院（Harvard Medical School） 三、试验设计 四、结果 1.鉴别（identification）人及小鼠粪便中的miRNA 由于正常肠道中是否拥有miRNA并未报道过，于是作者尝试分离、鉴定正常肠道中的miRNA。在分离得到粪便中的miRNA后，作者进行了系列分析。图1中的A、B，作者统计了人与小鼠粪便中丰度前50的miRNA，且图1C中韦恩图表明人与小鼠有17种共同种类miRNA。肠腔不同部位中的miRNA丰度有所不同，结肠比回肠的丰度更高，这与菌群分布正好相反，回肠中的菌群丰度较结肠更高（图1D）。为了确定肠道中菌群对粪便中的miRNA是否有影响，作者又比较了同为一窝的无菌小鼠（GF）与无特定病原菌小鼠（SPF）的粪便miRNA，发现无菌小鼠粪便中的miRNA丰度更高，且两组小鼠粪便中的miRNA组成上也不相同（图1E）。为了进一步验证菌群与miRNA的丰度是否是一种相关关系，作者又比较了SPF小鼠与抗生素处理小鼠的粪便miRNA组成，发现通过抗生素处理清除肠道菌的小组其拥有更多的miRNA（图1F）。 图1 鉴别（identification）粪便及肠腔内容物中的miRNA 注：D-F上侧为火山图，统计差异及差异显著性。横轴为Log2（X/X数量的倍数），纵轴为P值。图中小点表示某一种miRNA；下侧为PCA分析，分析组成的相似性或差异性。 2.肠上皮细胞及表达Hopx阳性细胞是miRNA的两大主要来源 粪便中miRNA的来源先前未被报道过，因为有研究表明肠上皮细胞（IECs）分泌外泌体（exosome），而作者发现miRNA存在于外泌体中，他们就设计实验来验证miRNA是否源自IECs。Dicer酶是在miRNA成熟过程中的必须酶，它参与miRNA的剪切。故作者培育了IECs细胞无Dicer酶表达的小鼠（Dicer1∆IEC），与IECs细胞表达Dicer酶的小鼠（Dicer1fl/fl）并比较两组小鼠粪便中的miRNA的丰度，图2A中火山图表明IECs细胞无Dicer酶的小鼠，其粪便中的miRNA减少了，所以可以得出IECs是miRNA的来源。同样的方法，发现Hopx表达阳性细胞也是miRNA的来源（图2B）。且在两种无Dicer酶的细胞中miRNA变化是不同的，故Hopx+细胞与IECs负责产生不同的miRNA。同时作者又用另一种方法去验证上述结论，即通过葡聚糖硫酸钠（DSS）处理小鼠诱导其得结肠炎(colitis)，从而破坏其肠上皮细胞且使Hopx+细胞之一——杯状细胞（globlet cells）丢失，用该种小鼠与未处理（naive）小鼠对比，发现前者粪便中的miRNA减少了，进一步说明粪便中的miRNA来源于肠上皮细胞。至此，细心的读者会质疑：粪便中的miRNA是由上皮细胞分泌进入粪便中的？还是粪便中的miRNA分离自脱落的上皮细胞本身呢？作者继续比较了上皮细胞与肠内容物中miRNA的组成，发现有很多miRNA是两者共有的，但肠内容物中许多种miRNA的丰度比上皮细胞高得多，这说明两者是有区别的，故排除粪便中的miRNA是分离自脱落的上皮细胞一说，印证粪便中的miRNA是上皮细胞分泌而来的。 另外作者还考虑淋巴细胞是不是粪便中miRNA的来源，于是其设计了实验进行检测。Rag1基因被敲除的小鼠不能形成淋巴B、T细胞，故作者构建了Rag1-/-与野生型型小鼠(WT)进行比较,发现两者粪便中的miRNA相差不大（图2D），故淋巴细胞不是粪便中miRNA的来源。
3.肠上皮细胞产miRNA缺陷使（同类型）小鼠肠道菌群组成相异度增大 为了明确miRNA是否影响肠道菌群，作者通过高通量测序肠道菌群的16S rRNA基因的V4区并进行生物信息学分析。通过比较肠上皮细胞Dicer酶缺陷小鼠与Dicer酶表达小鼠，发现两组小鼠之间菌群组成的几个菌门（Phyla）发生了改变，如厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacterial）。在科（family）水平上，缺陷小鼠拟杆菌科（Bacteroidaceae）、螺杆菌科(Helicobacteraceae)增多，普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）及疣微菌科（Ruminococcaceae）减少。（图3A）PCoA分析显示，与正常小鼠（WT）相比，缺陷小鼠组内小鼠之间肠道菌群差异较大（图3B），同时图3C、3D中对所有菌科Unifrac分析也印证了上述现象。（不加权Unifrac衡量系统发生相似性而加权Unifrac衡量丰度）。进一步地，他们将上一步所有菌科限制到具体某一菌科，对野生型小鼠（WT）中最多的3种菌科（Prevotellaceae、Porphyromonadaceae、Lachnospiraceae）进行距离分析（distance metric），图3E-3G显示缺陷小鼠与野生型小鼠之间存在明显，且在Prevotellaceae、Porphyromonadaceae两个菌科上差异尤为明显。然而，在Prevotellaceae方面却没有出现显著的beta多样性差异（补充图2B-2D），这表明缺陷小鼠间的beta多样性要不是因为物种组成上的差异、要不是因为特定细菌丰度上的差异造就的，为了确定是哪一种原因造成的，作者又利用基于Bray-Curtis算法计算整体OTUs，对属（Genus）水平的beta多样性进行分析（图3H），但由于缺陷小鼠之间beta多样性太高，并没有找到缺陷小鼠与野生型小鼠之间的主要差异OTU，仅仅找到缺陷小鼠较低的10个OTUs及2个较高OTUs。 图3 肠上皮细胞产miRNA缺陷使（同一环境）小鼠肠道菌群组成相异度增大 注：已有理论是同样坏境下，宿主肠道菌群组成会更为接近。缺少miRNA的存在，小鼠肠道菌群失去固有发展，两者关系好似指挥官之于士兵、磁铁之于铁。C-H为箱线图，箱子中的一条线为中位数，代表平均水平，箱子的宽度一定程度反应数据的波动程度。 Unifrac 度量的标准是根据构建的进化树枝的长度计量两个不同环境样品之间的差异，差异通过0-1距离值表示，进化树上最早分化的树枝之间的距离为1，即差异最大。不加劝的（unweighted）Unifrac 的计算是基于两样本间菌群组成差异，而加权的（weighted）Unifrac 还将物种丰度考虑进去。 4.宿主miRNA影响肠道细菌生长 miRNA会使肠道菌群差异增大，能不能影响肠道细菌生长呢？作者打算在体外（In vitro）验证一下。他们从肠道菌群中筛选了两株菌，一株厌氧菌Fusobacterium nucleatum (Fn)及兼性厌氧菌Escherichia coli (E. coli)准备培养用。作者想到细菌中是否存在miRNA的核酸序列靶点，故将两株菌、节段丝状细菌（SFB）以及其他影响宿主免疫的其他细菌的7段核酸序列输入到miRNA数据库miRbase检索miRNA的潜在靶点，发现一种细菌的核酸序列可以被多种miRNA靶定（补充图3A和补充表6）。明显地是，这些miRNA既来自低级别物种，像蠕虫（worm）、苍蝇等，也来自像人、小鼠等高级物种（补充图3A和补充表6）。这些miRNA既可以结合DNA的正义链也可以结合反义链，故可能是在DNA水平上调节基因表达，或直接作用于RNA。在这些miRNA中，发现miR-101, hsa-miR-515-5p, miR-876-5p, hsa-miR-325,以及hsamiR-1253 可能会靶定Fn的核酸序列，hsa-miR-4747-3p, hsa-miR-1224-5p,hsa-miR-1226-5p, hsa-miR-623会靶定E.coli的核酸序列（补充图3B-3G）。在获取这些信息之后，作者用这些miRNA与菌共培养，发现hsa-miR-515-5p能够促进Fn的生长，而hsa-miR-1226-5p促进E.coli的生长（图4A、4B和补充图3C、3F），这些结果说明miRNA直接影响细菌生长。作为对照，作者使用了碱基序列发生改变的变异miRNA，发现其并不能促进细菌生长，说明这种影响是依赖序列特异的。 图4 宿主miRNA直接影响肠道细菌生长 5.宿主miRNA进入细菌调控细菌基因转录 先前报道miRNA能进入线粒体调控线粒体基因表达，而线粒体进化起源于细菌是大家认可的理论，这些为miRNA调控细菌提供了理论基础。为了弄清楚miRNA是如何影响细菌生长的，作者考虑到上述的理论，假设miRNA也能进入细菌，因此用结合荧光（Cy3）的miRNA培养表达绿色荧光蛋白（GFP）的大肠杆菌，发现miRNAs进入细菌并于细菌核酸共定位，在Fn中也是如此（图5A-5D，补充图4B-4E，补充视频1、2）。他们进一步发现miRNA在细菌中出现聚集情况（图5E、5F），从时间与空间上都提供miRNA与细菌互相作用的证据。到此并不清楚，miRNA具体的作用机制，考虑到miRNA可能会调控细菌的基因表达来调控菌的生长，作者用hsa-miR-515-5p培养Fn，并用Q-PCR统计16S rRNA转录的数量，结果发现Fn中16S rRNA/23S rRNA的比例增大了（图5G）。相似的是，在大肠杆菌中miR-1226-5p 使yegH增多（图5H）。综上可以看出miRNA可以通过调控细菌的基因转录而影响细胞生长。
图5 宿主miRNA通过进入细菌特异调控细菌基因转录 6.野生型小鼠粪便miRNA移植恢复肠上皮细胞miRNA缺陷型小鼠菌群 既然体外（in vitro）试验中miRNA可以调控细菌基因，且多种miRNA可以靶定一种细菌基因，那么体内（in vivo）试验会怎么样呢？作者推理一系列的宿主miRNA可能会塑造肠道菌群的组成。为验证这一假设，作者做了如下工作。给上皮细胞产miRNA缺陷型小鼠及同一窝野生型小鼠饲喂细菌Fn，观察Fn的定殖情况，发现野生型小鼠粪便中的Fn水平显著高于缺陷型小鼠（图6A）。这表明宿主miRNA对于外来菌的定殖是有选择性的。进一步地，作者又补充了一个试验。分别将从野生型小鼠、缺陷型小鼠粪便中分离得到的RNA，通过口服移植给新一批的缺陷型小鼠，发现野生型小鼠的miRNA比缺陷型小鼠的miRNA更能减少新一批缺陷型小鼠肠道菌群的多样性，移植野生型小鼠miRNA的新一批缺陷小鼠其肠道菌群更接近野生型小鼠（图6C、6D）。同时qPCR技术检测3种对宿主免疫有影响的细菌试验也验证了恢复效果，其中的一些种或OTUs的丰度有的变少（图6G、6K），在检测的10个种细菌或OTUs中，有3种其丰度未得到恢复（图6G-6P）。 为了排除缺陷型小鼠肠道菌群是由其免疫系统中抗菌成分造成的，作者又测量了小鼠中IgA和RegIII-γ的含量，发现与正常小鼠并无区别，排除了宿主免疫成分会造成菌群改变的可能（补充图5C）。 同时将人工合成能促进大肠杆菌生长的miR-4747-3p 及miR-1226-5p饲喂野生型小鼠，发现小鼠粪便中大肠杆菌的丰度增加了（图6Q）。
图6 野生型小鼠（WT）粪便RNA移植使肠上皮细胞产miRNA缺陷型小鼠粪便中的微生物恢复 7.野生型小鼠粪便miRNA可缓解产miRNA缺陷型小鼠DSS诱导产生的结肠炎 鉴于miRNA可以影响肠道菌群的组成，那么实战怎么样呢？作者用DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导小鼠患上结肠炎（colitis），缺陷型小鼠相比于野生型小鼠，体重减少的幅度更加大（图7A），结肠更短（图7B），更高的细胞浸润（病理），大规模的丢失结肠组织完整性（图7C）。为了验证这些病理是丢失miRNA，还是内源上皮细胞缺陷造成的，作者在DSS诱导缺陷小鼠患上结肠炎7天之前饲喂野生型或缺陷型小鼠的miRNA（图7D），结果显示接种野生型小鼠的miRNA可以减少小鼠体重损失（图7E），拥有更长的结肠（图7F），较少的结肠损伤（图7G）。这些都表明肠腔中的miRNA在保护肠上皮细胞屏障的完整性方面至为重要。
图7 DSS诱导产生的结肠炎的恶化与肠上皮细胞产miRNA缺陷有关联，且野生型小鼠的粪便RNA移植能缓解该结肠炎症状 五、讨论 前部分作者把研究成果复数一遍，不做解读。 其展望的有以下几点： 1.miRNA能否以非EV（胞外囊泡）的形式存在，诸如与高密度脂蛋白（HDL）、阿尔古蛋白（argonaut，韩春雨老师研究的那个）等结合存在或者独立存在？ 2.miRNA进入细菌的机制及进入后如何调节的细节还不清楚，是结合DNA，还是结合RNA都有待研究。 3.miRNA可以调控肠道菌群，这或许是肠道疾病治疗的一个新机遇。 六、点评 这是一篇研究宿主与菌群互作（interactions）的文章，宿主通过核酸材料与菌群互作。miRNA的研究在上世纪90年代就开始了，但在近期才开始关注其在物种间互作（inter-species communication）的作用，本研究发现粪便中的miRNA可以调控肠道菌群的生长，算是新的发现，具有较强的创新性。先前人们了解的是，宿主的饮食、免疫会影响到菌群，而文章开拓了菌群研究人员的视野，将菌群与宿主互作的方式扩展到基因调节层面。继续深入的研究或许能够开发出miRNA相关药物，通过调节肠道菌群来改善宿主的健康状况。研究结论意义较大。 另外，文章只是阐明了（demonstrate）宿主可以通过粪便中的MicroRNA塑造菌群，对塑造机制研究尚浅，miRNA塑造菌群的程度、幅度也没有得到很好的研究，故只能屈居Cell子刊。但这也给后来人留下机会，宿主通过miRNA调控菌群的研究还有很大空间。
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