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原文题目：The past, present andfuture of microbiome analyses 期刊：Nature protocols IF：10.032 发表时间：2016年9月29日 通讯作者：Erin S Baker 和 Janet K Jansson 通讯作者单位：美国太平洋西北国家实验室 导读 微生物约35亿年前出现在地球上，时至今日它们栖息在这个星球的各种环境中。尽管我们知道微生物在地球上起着重要的作用，比如碳、氮等元素循环、影响动植物的健康，但多达99%的微生物资源还没被挖掘。因微生物多样性的高度复杂，我们很难将微生物组的功能研究透彻。幸运地是，在过去几十年间技术的进步大大提高了我们研究复杂微生物组的能力。本文将探讨用于微生物组分析的核酸测序及质谱技术的最新进展。 1.核酸测序技术 1.1 新一代测序技术（Next-generation sequencing） 微生物组研究的快速发展依赖于速度、通量不断增加的核酸测序技术，尤其是革命性的新一代测序技术平台的出现，且新一代测序技术已经超越传统的在测序领域主导近30年的桑格（Sanger）测序技术（从1977年至2005年）。新一代测序技术出现以前，使用“桑格双脱氧链终止法”对单个细菌的基因组进行测序往往会花费数年时间。1995年，流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza）是用桑格法完成基因组测序的第一个细菌（大肠埃希菌完成于1997年）。而现在，由于快速、价廉的新一代测序技术（NextGen）的存在，在数小时之内便可完成对一个细菌基因组的测序。 NextGen测序技术有数种不同的高通量测序平台。第一个出现的是Roche GS20 454测序仪，测序基于聚合酶裂解焦磷酸，故其也被称为焦磷酸测序（pyrosequencing）。454测序是测序技术里程碑式的进步，其包括GS20及GS FLX等系列仪器及试剂。454测序技术运用已经超过10年（2005年起），其有许多缺陷，包括昂贵的测序试剂、高均聚物（homopolymer）出错率（比如测通复杂重复序列时）以及因表面负载能力限制而导致的通量和测序数较低的现象。第二个NextGen测序仪是2006年出现的Solexa（现为Illumina）基因组分析仪（GA），其采用边合成边测序技术（Ssequnceing by sythesis），DNA与流动槽基底上的Oligo序列互补经桥式PCR扩增成簇，最后捕捉荧光信号完成碱基确认。这项技术经常用于人类及环境微生物组核酸材料的测序，运行一次就能产生大于1.8兆（TB）碱基对的数据，其终极目标是1000美元完成个人基因组（人单倍体约3000兆碱基对）测序。Illumina公司目前拥有若干技术平台，如GA、MiSeq及HiSeq测序仪器，这些平台拥有不同的读长（双端读长100-300个碱基对），不同的测序通量。拿MiSeq平台来说，其读长最大，约为500-550碱基对，但其测序通量比HiSeq平台低，HiSeq平台运行一次可以产生约十亿个读长（reads）。Illumina公司研发的新测序方法叫做TruSeq 合成长读长（TruSeq synthetic long reads），也叫Moleculo，能产生更长的读长（>8 kbp），这使得微生物基因组能够拼装出更长的重叠群（contigs）。 1.2 单分子测序技术 新兴测序技术在微生物组研究利用方面，展现出更快、更信息化的巨大潜力，其中包括单分子测序技术（ single-molecule sequencing）。其中一个例子是PacBio公司研发的单分子实时测序技术（SMRT），能够实现单个DNA分子的测序，并且实时监控测序结果。PacBio的单分子测序技术目前能够进行每一SMRT槽约10-25kbp与300Mbp两种规格的长DNA序列读长测序。由于使用的聚合酶能够使核酸滞留（tethered polymerases）数十毫秒，PacBio的单分子测序平台在核酸合成时可以检测到被修饰的核苷酸，如DNA甲基化。 Oxford纳米孔测序平台（Oxford Nanopore sequencing）也是单分子测序的代表之一。Oxford测序平台与目前的其他平台的测序原理不一样，它不依赖于合成测序，其通过让核酸序列进入纳米孔直接对核酸序列进行测序。Oxford平台与PacBio平台一样也可以检测被修饰的DNA序列，其平均读长约1-2kbp，其最大读长（maximum read length，>90kbp）是所有平台中最长的最大读长。Oxford纳米孔测序仪最大的优势是其只有拇指般大小，可以直接连接个人电脑对测序数据进行实时分析。 过去5年间，PacBio公司的测序平台在微生物组从头（de novo）测序及宏基因组测序组装应用方面发展地十分强劲。但PacBio的测序平台缺陷是需要具有高分子量DNA（>40kbp）的微生物样本才能建库，缩小了其可测的样本范围。而Oxford Nanopore提供了价格便宜且拼接支架（scaffolds）较大（>50kbp）的方法，这一点增加了直接对环境样本测序基因组的闭合性（closure）及重建性（reconstruction）。单分子测序技术目前仍存在巨大的挑战，如何在数量极多的碱基对中获得高质量、高分子量的DNA序列是其未解决的问题。Oxford及PacBio测序平台对于大规模的研究其测序通量还是太低，但是对于序列拼接应用方面，这些单分子测序平台在微生物组的研究方面还是前景光明的。 1.3 宏转录组学 对总mRNA的测序，可以在时间上和空间上掌握某一有机体的哪些基因在表达。宏转录组测序已经为我们提供了大量信息，让我们了解到各种生态环境中微生物基因表达的情况，包括排泄酸性矿水、人类肠道、海洋及土壤。如，Gilbert等人利用宏转录组研究了英吉利海峡中微生物组基因表达随季节的变化。最近，我们使用了宏转录组来确认土壤中的哪些有机体处于活跃状态，发现，尽管疣微菌门（Verrucomicrobia）在泥土中丰度很高，但是其mRNA的表达量却很少，表明它们实际上处于“休眠”状态，相反厚壁菌门（ Firmicutes）的基因表达很活跃。这些都说明宏转录组在验证宏基因组结果及掌握微生物群落中微生物活跃水平方面的实用性。 2.基于质谱技术的宏蛋白质组学及代谢组学 DNA测序技术的进步使我们能够掌握菌群中微生物系统发生及功能的基因组成，但是我们还想知道特定条件下会有哪些蛋白、哪些代谢物产生以及环境因素对微生物行使功能的影响。对不同样品微生物组产生蛋白和代谢物的评估与检测主要依靠质谱（MS，mass spectrometry）技术完成。在使用质谱分析微生物组时，目标生物分子被电离后根据质荷比（mass-to-charge ratio）进行分离，然后被检测。质谱技术为宏蛋白质组学及代谢组学提供了高灵敏、高分辨率及高通量的测量方式。 1984年电喷射离子化（ESI，electrosprayionization）技术的引进使质谱技术测量、评估生物分子更加实用。ESI技术存在一个问题，就是电离化是在正常大气压（760 torr）下进行的，而质谱分析仪的工作气压在10-6和10-11之间，两者之间相差超过9个数量级。如果待检测生物分子离子化设备与质谱分析设备不能很好配套，大量的离子就会流失。因此用离子漏斗加四极子传输装置设计的交界面，在减少压强的同时对离子进行重调焦距，是过去二十年最佳的方法。电离化技术领域的进步是减少离子流失及质谱检测高灵敏度的关键。 然而，由于给定样本中组成成分数量巨大、范围高度动态，用质谱分析复杂微生物组中的生物分子仍然存在困难，这一困难的解决依赖于质谱检测仪器的分辨率、精确度及MS/MS速度。在2005年静电场轨道阱（orbitrap）技术未面世之前，四极子、离子阱、飞行时间（TOF）及离子回旋共振质谱分析是质谱分析的主要组成成员；在1990年至2000年间，只有少部分的实验室能够使用离子回旋共振质谱分析进行高分辨率的研究，而orbitrap技术让高分辨率的质谱分析走进普通实验室。 过去十年间电场轨道阱技术进步迅速，其结合了线性离子阱及静电场轨道阱的高分辨率测量及更快的MS/MS扫描率的优势。然而，由于微生物组样本的复杂性，其他附加技术，如，一维、二维液相色谱分离及气相离子移动光谱技术也应被应用于质谱分析，从而增加样本中鉴定到的蛋白及代谢物的数量。这些分离技术减少了样本在检测之前的复杂度，使得离子阱及检测器更少地出现被抑制现象，也提高了检测给定样本中蛋白及代谢物的覆盖度。 3.复杂度在增加的微生物组：限制发展因素及未来的方向 十年来，核酸测序技术及质谱技术的发展使分析多种环境中的复杂微生物组成为可能。例如，早在2000年，Banfield及同事就使用了测序与质谱结合的方法研究微生物多样性较低的排泄酸性矿水中的微生物组，其是第一位将二者结合使用的研究人员。随之而来的，研究微生物组的领域变得更为广阔、复杂，如切叶蚁栖息地（切叶蚁会利用植物叶片培养真菌）、白蚁肠道、人类肠道、沉积物、海水、永久冻土及草原土壤，其中的研究方法涉及测序、质谱技术或者二者的结合。技术一直在提高，我们期待获取更多种群落微生物表型方面的信息。 在获取更深层次理解微生物组分子功能的路上，仍然存在许多困难需要解决。微生物群落分析的最大一个瓶颈是生物信息学及运算方面的难题，包括建设基因目录、群落注释平台，以此提高多组学结合研究的能力。微生物组分析的其他几个挑战包括：在高度多样极度复杂的样品中抽提生物分子（核酸、蛋白质及代谢物等），像土壤、沉积物及人类肠道等样品都是复杂的样品；直接从复杂生态环境中拼装出完整的基因组而不只是序列片段；为宏蛋白质组及代谢组研究提供高通量、高速度、高范围的质谱分析；满足从头组装大规模宏基因组及宏转录组的高计算量随机存储器（RAM）的需求；对于太字节至拍字节数据的足量存储及多种分析选择；发展统计及数学模型对数据进行整合并产生有意义的生物学视点。 除了严峻的挑战，微生物组分析的前景看起来也是光明的。2016年，白宫科学与技术政策局（OSTP）宣布发起国家微生物组计划（NMI），由数个联邦机构、产业及基金会提供经费资助，目的是提高微生物组分析技术及全面掌握+微生物组。我们认为这项计划将会促进信息化核酸测序及质谱分析的更快发展，也会促进微生物组分析相关生物信息学的发展。我们也期望这一计划会带来新的更高分辨率的多肽、代谢产物离子迁移分离技术及新的分子生物学数据库。接下来的十年，提高技术及计算能力，对于破译微生物在自然环境中扮演的角色、确认微生物对生态的可持续发展方面尤为重要。如此深入的掌握微生物群落的表型组有利于我们更好地理解外界因素（如，气候变化、疾病状态）对微生物组功能的影响，有利于我们更好地预测这些变化的发生，有利于我们提高生态的可持续发展性及人类健康水平。 评语 测序技术进步带动的宏基因组学、宏转录组学加之质谱技术发展促进的宏蛋白质组学、代谢组学共同构成了研究微生物组的多组学（omics），从而使我们知道环境中的微生物“有谁、可以干什么、准备干什么、正在干什么及干的怎么样”。但多达99%的微生物资源的开发，仅靠多组学技术是不够的，传统的纯培养技术也会在微生物学的研究中起到重要作用，使现在不能培养的微生物可以进行实验室分离纯化也是微生物研究亟待解决的难题，幸运地是，美国东北大学研究者发明的环境微生物培养利器iChip已渐显作用。请相信，技术的发展进步定会使我们“攻破”菌群之城。 参考文献 White R A, Callister S J, Moore R J,et al. The past, present and future of microbiome analyses[J]. Nature Protocols. 2016, 11(11): 2049-2053. Nichols D, Cahoon N, Trakhtenberg EM, et al. Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species[J]. Appl Environ Microbiol. 2010,76(8): 2445-2450. Ling L L, Schneider T, Peoples A J,et al. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance[J].Nature. 2015, 517(7535): 455-459. 本文由朱见深原创创作，江舜尧编辑。可联系江舜尧（微信二维码见文末）获取免费转载权限；没有获得授权不能转载。 菌群采样用啥工具？我有菌群采样神器！ 详情点击：菌群采样神器，样品常温快递 |
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