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本文由面瘫的猫编译，董小橙、江舜尧编辑。 原创微文，欢迎转发转载。 本研究针对40种代表性的肠道细菌筛选了1000多种市售药物，发现24%具有人类靶点的药物，在体外抑制了至少一种细菌的生长，这些药物的剂量相关性也在体内进行了验证，相应的结果与患者数据具有一致性。对抗生素和靶向人体药物的敏感性与细菌种类相关，而且非抗生素类药物促进抗生素耐药性的潜在风险值得进一步探索。 论文ID 原名：Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria 译名：非抗生素类药物对人体肠道细菌的广泛影响 期刊：Nature IF：41.577 发表时间：2018年 通信作者：Athanasios Typas 通信作者单位：欧洲分子生物学实验室基因组生物学单元及结构与计算生物学单元 实验内容 许多药物具有胃肠道副作用，但很少有人关注肠道菌群在这些药物产生副作用过程中的作用。最近，一些研究发现靶向人体细胞而非微生物的药物，如抗糖尿病药(二甲双胍)、质子泵抑制剂(PPI)、非甾体抗炎药和非典型抗精神病药(AAPs)的使用与肠道菌群组成的改变有关。而一项更大规模的队列研究表明，药物可以更普遍地改变肠道菌群的组成。由于尚不清楚这些药物对肠道菌群的作用是否是直接的，以及是否仅局限在所研究的几种药物中，我们系统地描述了药物与肠道细菌特定种属之间的相互作用，以期系统了解药物对肠道菌群的作用，为进行深入的临床和机制研究，改进临床治疗方案及药物研发提供依据。 1 针对肠道菌群的药物高通量筛选 我们在37℃厌氧条件下的改良岐阜厌氧培养基（mGAM）肉汤中培养40株代表性菌株，在一定程度上重现人体肠道菌群中物种的相对丰度，然后用1197种药物处理并监测菌株生长。筛选的化合物（1079种）涵盖了人类可用的所有治疗药物，其中3/4（835种）是靶向人体的药物（即在人类细胞中有分子靶点），而其余的是抗感染药：156种具有抗菌活性（144种抗生素，12种防腐剂），88种对真菌、病毒或寄生虫有效（图1a）。所有化合物均在20μM浓度进行筛选（高通量药物筛选中的常用浓度）。 为尽可能涵盖健康个体的肠道菌群，我们对菌种进行了选择，入选菌种必须具有在人类肠道中的普遍性和丰富性，以及系统发育多样性。最终，我们从21个属的38种细菌中分离出40株人肠道菌株，大多数菌株是共生性的，覆盖60个测序物种中的31种，其相对丰度达1%或更高，在来自三大洲的健康人类的粪便样品中至少占据50%。此外，还包括4种致病菌、1种益生菌（副乳杆菌）和2种共生的梭菌种（分枝杆菌和糖酵解梭菌）。所有38个菌种都在健康个体的肠道中发现。 利用多孔板筛选所有化合物，测量每个孔内含菌种的培养基随时间变化的光密度改变，定量生长曲线下的面积(AUC) 监测加入化合物对细菌生长的影响，直到细菌生长进入平稳阶段。每个菌株设置至少三个重复，并检测其生长标准化AUC分布的显著偏差，合并重复孔的P值，对药物和菌株的模型进行多重假设检验。能够显著降低至少一种菌株的药物(错误发现率FDR<0.01)被认为是具有抗共生菌活性药物，具有调节人类肠道菌群的潜力。 在测试的156种抗菌剂中，78%对至少一种菌株具有抗菌作用，通常具有广谱性（图1a，b）。而未显示抗共生菌活性的抗生素主要有磺胺类（在所使用的培养基中是没有活性的）、氨基糖苷类（在厌氧条件下活性受损）和特殊的抗分枝杆菌药物。 值得注意的是，27%的非抗生素类药物在筛选中也具有抗共生菌活性，半数以上针对病毒或真核生物的抗感染药物表现出抗共生菌活性（47种药物；图1a，b），一些药物的抗菌活性此前从未被报道过（例如，抗病毒药物沙奎那韦和三氟尿苷）。更值得注意的是，203种（24%）靶向人体的药物具有抗共生菌活性。除40种药物影响至少10株菌株外，大多数药物仅对少数菌株有效，其中14种以前未见抗菌活性报道。这些药物或其支架可用于某些广谱抗生素在临床的重新利用，特别是因为他们中的许多具有每毫升亚微克级的最小抑制浓度(MIC)。而且，大多数靶向人体药物的微生物窄谱特异性可以帮助开发微生物调节剂。 细菌对药物的反应各不相同，其中罗氏弧菌、直肠真杆菌和普通拟杆菌最敏感，γ-蛋白杆菌最具耐药性（图1a）。总体而言，健康个体间相对丰度较高的菌种对靶向人体药物的敏感性显著高于其他菌种（基于Spearman相关性P=0.0012；图1c）。这表明靶向人体的药物对肠道菌群的影响更大。 图 1 2 药物筛选的剂量相关性及其验证 大多数肠道菌群所在的末端回肠和结肠处，而血浆中靶向人体的药物平均浓度比我们筛选时所用的浓度要低一个数量级（图2a）。我们根据已有研究和测量推断结肠和小肠药物浓度。基于这些近似值，筛选时所用的20μM低于药物在人体小肠和结肠实际的中间浓度（图2a）。值得注意的是，具有抗共生菌活性的靶向人体药物在血浆和小肠估计的浓度比没有抗共生菌活性的药物更低(图2a；P=0.0061和P=0.0035，双侧Wilcoxon秩和检验），这表明如果以更高的剂量，更接近生理浓度，更多的靶向人体药物将抑制细菌生长。例如，二甲双胍最近被鉴定为导致II型糖尿病患者肠道菌群组成变化的关键因子，但在我们的筛选中缺乏抗共生菌活性。二甲双胍在患者血浆中达到10-40μM，但其小肠浓度高30-300倍，与我们估计的小肠和结肠浓度接近（1.5mM）。当我们在体外使用更高、更具生理性的肠内二甲双胍浓度时，22个测试菌株中有3个在1.5mM以下浓度受到抑制。 我们也针对筛选结果进行了独立实验，研究了25种药物针对多达27株菌株的IC25（造成25%生长抑制的药物浓度）。分析具有良好的精度（94 %），但重复性略低（85%）。假阴性，也就是，筛选时漏掉了具有抗共生菌活性的药物，是由于在筛选过程中特定化合物可能失去活性及严格的FDR界值造成的。如果将界值增加到0.1会使具有抗共生菌活性的药物比例增加一倍。此外，我们发现较高药物浓度可抑制更多菌种，而IC25值低于估计的肠道浓度，偶尔低于血浆浓度。 此外，我们仅筛选了具有代表性的菌种亚群，如果检测更多的肠道菌种，具有抗共生菌活性的靶向人体药物的比例将会增加（图2b）。综上所述，我们在生理相关浓度范围内检测了靶向人体的药物，而且可能低估了其对肠道细菌的影响。 图 2 3 与患者数据的一致性 在证明许多靶向人体药物在体外抑制肠道细菌后，我们寻找这样的效应在体内表现的证据。回顾宏基因组学研究的所有临床队列数据，结果发现PPIs、AAPs和另外7种药物适合我们进行研究，根据解剖治疗化学（ATC）分类，这些药物涉及5个类别。我们筛选的所有3个PPI类药物都显示出广泛的抗共生菌活性，与服用PPIs (图3a)的病人所报告的肠道菌群变化相似。这表明，PPIs可以直接影响肠道菌群的组成，影响到达肠道的细菌。一个大队列研究鉴定出的免疫抑制剂硫唑嘌呤、抗抑郁剂文拉法辛、抗炎性美沙拉嗪、氨基水杨酸酯、孕酮、雌激素和阿莫西林与菌群的相关性也同样较高；唯一的例外是抗生素呋喃妥因。我们还将研究数据与AAPs治疗导致患者肠道内阿克曼属水平降低的研究报告比较(筛选包括了这项研究中10个AAPs中的6个)。结果发现，嗜粘液阿克曼原虫比其他菌株对AAP更敏感（P=0.09；双侧Wilcoxon秩和检验），而对其他靶向人体药物更耐药（P=0.0005，双侧Wilcoxon秩和检验）。最后，我们发现服用二甲双胍的患者的纵向微生物学研究与我们检测到的IC25数据高度一致。 宏基因组学研究和我们的体外研究具有明显局限性。我们筛选了一个菌种的亚群，脱离了微生物群落和宿主背景。队列研究也可能缺乏统计学效能或造成偏倚，并且可能检测到间接影响。尽管如此，我们发现药物在体外和体内的效果高度一致，证实了上述药物的临床相关性和直接抗共生菌活性。 为了进一步评估我们筛选的生理相关性，我们调查了这些药物在人体内的副作用。我们首先确定用于全身使用的抗生素所具有的69种副作用。相比没有抗共生菌活性的药物，抗生素相关的副作用在具有抗共生菌活性的靶向人体药物的临床试验中更常见(P=0.002，双侧Wilcoxon秩和试验)，而对于安慰剂没有观察到显著差异（图3b）。这表明，靶向人体的药物对肠道细菌的间接损害可以体现为抗生素样副作用的较高发生率。 然后我们研究了这种副作用是否可以预测由于采用低药物浓度而可能错过的靶向人体药物的抗共生菌活性。我们在2.5mM浓度筛选了42种药物对18个菌株生长的影响，其中26种具有抗生素相关副作用，而16种不具有。结果28种药物抑制了至少一株菌株的生长，对于候选药物和对照药物，药物的活性部分和受影响菌株的数目都相似。当我们通过药物肠道估计浓度标准化测量的IC25使药物之间的量具有可比性时，差异变得显著。预测具有抗共生菌活性的药物在所有的药物-菌株对中的IC25中位数对应于4.3次药物剂量，而对照药物为12次（P=5.6×10-7，双侧Wilcoxon秩和检验；图3c）。在34%具有预测抗共生菌活性的药物中，IC25少于2个药物剂量，而对照药物仅为8%。类似地，对于16/52（31%）候选药物-菌株对和仅5/50（10%）对照药物-菌株对，IC25低于估计的结肠浓度。 综上所述，具有抗共生菌活性的靶向人体药物在体内具有抗生素样副作用，这些药物的使用导致了菌群的变化，这意味着我们报道的更多的具有抗共生菌活性的药物，会在体内产生影响。 图 3 4 抗共生菌活性的药物特点 来自所有主要ATC指示区的药物都显示出抗共生菌活性，抗肿瘤药物、激素和以神经系统为目标的化合物比其他药物更能抑制肠道细菌，3个ATC亚类（抗代谢药物，抗精神病药物和钙通道阻滞剂）也明显更多。抗代谢药物用作化疗和免疫抑制剂，与RNA或DNA结合，或与合成酶相互作用，对人细胞具有细胞毒性，而它们的分子靶点在细菌中通常是保守的，这解释了观察到的现象，而且增加了抗菌作用直接参与化疗期间粘膜炎发展的可能性。 抗精神病类药物具有抗共生菌活性，这一点耐人寻味，因为他们的目标是大脑中多巴胺和5-羟色胺受体，而这里是不存在细菌的。尽管已知吩噻嗪类药物具有抗菌作用，而且几乎所有的子类化学药物都具有抗共生菌活性。这些药物靶向的物种，其相似性比预期的药物化学结构相似性更明显（P = 2×10-19）。这就提出了一个可能性，直接抑制细菌不仅表现为抗精神病药物的副作用，而且也是其作用机制的一部分。 不同的ATC指示区域包含相似的化学药品，我们研究的是药物的化学性质可以影响他们的抗共生菌活性。在某种程度上，化学上近似的靶向人体药物在筛选中的作用比不太近似的药物更接近。我们测试了复杂度、分子量、拓扑极性表面积（TPSA），体积和疏水性（XlogP）等几种化合物性质。复杂的、较重、较大的化合物优先针对革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性菌则通过它们的选择性外膜屏障免受此类较大药物的侵害。我们没有研究具有抗共生菌活性的药物中存在的所有化学组分。然而，我们确实观察到具有抗微生物活性的药物富含活性硝基（P=6.4×10-6，Fisher精确测试），表明局部化学性质可能赋予药物抗菌活性。 5 靶向人体的药物可能提高抗生素耐药性 在我们的研究中，对抗菌药物的耐药性与对靶向人体药物的耐药性之间有很强的相关性，这不能简单地用细胞包膜成分来解释，因为革兰氏阳性菌和阴性菌之间没有明确的区别（图4a）。我们推测，更具体但共同的机制可以赋予两类药物组的耐药性。为了验证这一假设，我们选择已知在大肠杆菌和其他细菌中外排几种抗生素的TolC作为对抗生素耐药机制的显著代表。我们对大肠杆菌ΔTolC突变体及其亲本野生型（BW25113）进行了化合物处理分析。缺乏TolC的大肠杆菌不仅对抗菌药物更加敏感（比野生型多22种敏感化合物），而且对靶向人类药物也同样敏感（19种额外敏感化合物；图4a）。这种效应对大肠杆菌或TolC不是特异的，因为耐药性更强的均匀分枝杆菌菌株（HM-715）对靶向人体药物也同样具有更强的耐药性（图4a）。 虽然我们的数据支持了普通抗性机制，但也存在例外，其中最突出的是艰难梭菌和远缘梭菌（图4a）。对于两者而言，较强的抗生素抗性与相对较弱的抗靶向人体药物的耐药性形成对比。同样，抗药性B.脆性菌株HM-20对靶向人体药物不具有耐药性（图4A）。 为了更系统地阐明靶向人体药物的耐药机制，我们在大肠杆菌中筛选出7种非抗生素（6种靶向人体药物和抗寄生虫药物氯硝柳胺）的全基因组过表达文库，显示出广泛的抗菌活性。由于野生型大肠杆菌是最具耐药性的肠道菌种之一（图4a），我们使用了ΔtolC突变体，它对大多数药物敏感。除了二甲双胍，所有试验药物处理后，tolC的过度表达减少了大肠杆菌的生长抑制。此外，我们鉴定了多种抗药性的转运子家族（图4B），通过转录因子、核糖体成熟因子rrmA以及解毒机制(硝基还原酶修饰含硝基抗生素)的过度表达，菌株也获得耐药性，说明这种方法在鉴定人类靶向药物的细菌作用机制方面的潜力。 所有这些结果都表明对抗生素的耐药机制和靶向人体药物的耐药机制之间存在重叠，暗示了使用非抗生素药物可能获得与抗生素耐药性相似的风险。 图 4 评 论 本研究系统地揭示了1000多种市售药物在体外和体内对肠道细菌的抑制作用，阐述了靶向人体药物的抗菌特性，还探讨了这类药物可能增加抗生素耐药性的风险。研究内容为今后药物与肠道菌群相互作用的研究提供了参考，为副作用控制和药物再利用开辟了新的途径，并拓宽了对我们抗生素耐药性的认识。小编能力有限，如有不足之处，还请指出，大家多多交流。感兴趣的朋友可通过查看原文了解更多。
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