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本文由沐秋编译，董小橙、江舜尧编辑。 原创微文，欢迎转发转载。 生长在土壤中的植物根部分布着不同科属的细菌群落，这些细菌群落可以促进植物生长(Hacquard et al., 2015)。除了细菌微生物群外(Lebeis et al., 2015; Bai et al., 2015; Castrillo et al., 2017)，植物根部同时会有一些土壤中的丝状真核微生物如真菌和卵菌寄生(Mycota and Chromista; Ruggiero et al., 2015)。微生物-微生物互作动力学已成为叶际的一个重要特征(Agler et al., 2016)，研究表明这些互作特征也在植物生长中发挥作用，包括对植物生长的协同作用(van der Heijden et al., 2016)，保护植物抵抗病虫害(Santhanam et al., 2015)，以及促进菌根共生(Garbaye, 1994)等。然而，原核和真核微生物在土壤-根连续体之间的相互作用以及不同微生物界之间的相互作用对于构建根系微生物群落的相关性迄今为止很少受到关注(Hassani et al., 2018)。通过分析天然拟南芥种群的根系三种微生物群（细菌，真菌，卵菌）并建立用于微生物群重组实验的参考微生物菌种库，我们从群落层面证明了根系原核和真核微生物群成员之间的负相互作用对于植物宿主存活和维持宿主-微生物群平衡至关重要。 论文ID 原名：Microbial Interkingdom Interactions in Roots Promote Arabidopsis Survival 译名：根系微生物跨界互作促进拟南芥存活 期刊：Cell IF：31.398 发表时间：2018年 通信作者：Paul Schulze-Lefert, Ste´ phane Hacquard 通信作者单位：Max Planck Institute for Plant Breeding Research, 50829 Cologne, Germany 实验内容 1 根系相关微生物组合情况分析 从三个拟南芥自然种群（两个相距较近的德国地点以及一个较远的法国地点）采集植物样品，每个种群取四个重复，每个重复四个拟南芥样本，相应的采集土壤样品，根分为根外表和根内表。通过对细菌16S rRNA基因和真菌以及卵菌内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)区域的DNA扩增子同时测序，对土壤-根连续体中的多个界内的微生物聚生体进行了分类鉴定。α多样性指数表明从土壤、根外表再到根内表的微生物多样性呈现逐渐降低的趋势(图S1C)。通过线性模型对土壤、根外表以及根内表OTU(operational taxonomic unit)富集检验，确定了96个细菌OTU、24个真菌OTU和1个卵菌OTU在所有三个取样点的拟南芥根部中始终富集(图1B)。这说明，对于三个微生物界中的每一种微生物来说，根外表对于其进入根内部都有类似门的控制作用。通过检查样本间变异(β多样性，Bray-Curtis距离)，我们发现细菌群落根据根部不同部位沿第一主坐标轴(PCoA)轴分布，而解释真菌和卵菌群落距离差异的主要因素是宿主的地理位置。微生物共发生网络分析(图S1D和S1E)和置换多元方差分析(PERMANOVA检验; STAR方法)证实了根不同部位和取样地点在细菌(部位：41%，p<0.001; 取样点：19%，p<0.001)，真菌(部位：21%，p<0.001; 取样点：43%，p<0.001)和卵菌(部位：14%，p <0.001;取样点：37%，p<0.004)群落结构中存在对立效应(图S1D和S1E)。综上结果表明：地理距离远的拟南芥种群的根系细菌群落分布在分类学上相似，但是卵菌和真菌的群落分布则往往具有取样点特异性。 图1 三个拟南芥群体的微生物群落结构（A）三个取样点（Pulheim、Geyen、Saint-Die）土壤、根外表、根内表中的细菌、真菌、卵菌的相对丰度。物种分类基于RDP数据库，采用bootstrap阈值0.5。所有样品中平均丰度小于0.5%的归为低丰度并标为黑色。每个技术重复包括4株植物的混合。（B）不同地点和不同取样部位显著富集的OTU相对丰度。采用广义线性模型比较某一样本的OTU与另外两个样本的OTU，p<0.05并使用FDR校正。OTU的相对丰度整合到纲水平。（C）36个样品细菌、真菌、卵菌的群落结构的主成分分析。根据Bray-Curtis距离画主成分分析的前两轴。不同颜色表示取样点，不同的符号表示取样部位。 图S1 天然拟南芥群体的微生物群落简介（A）三个拟南芥群体的发育阶段和种植位点。包括两个地理上较近的群体Geyen、Pulheim（德国）以及较远距离的Saint-Die（法国）。所有群体在2014年春天开花期取样。（B）分离方法。对于每个生物学重复(n=4)，每四单株从种植的土壤中取出，样品被分成了土壤、根外表、根内表。（C）不同取样点和部位的样品的α多样性。Shannon指数柱状图（上）、Chao指数柱状图（中）和观察到的OTU数目（下）。对于每三个指数，将所有位点的样品纳入考虑（稀释到1000个reads）。每个箱线图内的单个数据点对应三个取样点的样本（圆代表Geyen,三角形代表Pulheim，方块代表Saint-Die´）。ns, 非显著。*表示p < 0.01, ** 表示p < 0.001, *** 表示p < 0.0001（Kruskal-Wallis test）。（D）不同地点和部位的微生物共发生网络。网络显示单个微生物群体在不同部位和地点的微生物OTU共发生模式。图为基于Spearman相关性的网络。将至少两个样本中的读数大于200的微生物OUT考虑在内。仅显示相关分数>0.6的边缘（p<0.05，Bonferroni校正）。对于每个微生物OTU，按取样部位（上部）和地点（下部）分别着色。（E）每个微生物网络的节点混合。对于每个微生物网络（左边：细菌，中部：真菌，右边：卵菌），混合的节点数量根据每个OTU的部位和地点附属关系进行画图。 2 根部微生物跨界联通性 微生物界间和界内部OTU之间的网络分析表明，与α多样性指数一致，微生物网络复杂性从土壤到根内表逐渐降低。对根网络结构(根内样本)的研究表明细菌和真菌之间的OTU主要呈负相关(92.0%)，而细菌(87.7%)和真菌(89.7%)组内的OTU主要呈正相关(图2A和2B)。通过计算分类群的细菌-真菌相关性的强度（包含了至少5个OTU）发现，属于β变形菌纲(Betaproteobacteria)，杆菌(Bacilli)和δ变形菌(Deltaproteobacteria)的细菌OTU，以及属于座囊菌纲(Dothideomycetes)，锤舌菌纲(Leotiomycetes)和银耳纲(Tremellomycetes)类的真菌OTU，分别与细菌和真菌OTU最强负相关。简单来说，网络分析表明植物根部的几种细菌和真菌分类群之间存在强烈的负相关。
图2 拟南芥根际内表微生物群的网络（A）自然群体中拟南芥根内表的根系微生物OTU相关性网络。每个节点代表一个OTU,每个节点之间的边对应由OTU的丰度推断的正相关（黑色）或者负相关（红色）（p < 0.05, correlation values < -0.6 or > 0.6）。不同的颜色表示不同微生物界的OTU，节点大小反映它们在根内表中的相对丰度。用虚线表示界内部相关性，用实线表示界间相关性。(B)根内表网络中呈现正相关（黑色）和负相关（红色）相关性的边的比例。B，细菌；F真菌；O：卵菌。（C）在细菌和真菌OTU之间的微生物网络中测量的累积相关性得分。细菌（左）和真菌（右）OTU按纲水平分组（每个纲多于5个OTU），并根据它们与真菌和细菌OTU的累积相关性分数进行排序。（D）负相关细菌和真菌OTU的枢纽特性。对于每个真菌和细菌OTU，界间负相关频率根据所有负BF连接推断的中介中心性绘制（其中节点位于所有其他节点对之间的最短路径上的情况）。五个表现出高负相关频率和中介中心性得分的微生物OTU代表“拮抗”的网络的中心，并用数字突出显示：（1）Davidiella，（2）Variovorax，（3）Kineosporia，（4）Acidovorax，和（5）Alternaria。 3 不同微生物界的微生物重组 作者收集了根系微生物培养物，分离根系丝状真核微生物、真菌、卵菌等，构建了7个复杂的由148个细菌（B），34个真菌(F)以及8个卵菌（O）组成的人工合成微生物群落，以及对应的多界微生物聚生体组合（BO,BF,FO,BFO）（图3）。在含有泥炭和蛭石的无菌FlowPot系统（作为无菌土壤基质）放置表面灭菌的拟南芥种子，共培养这些微生物群落和植物宿主4周后，在没有根共生细菌（F，O，FO）的情况下，丝状真核微生物对植物生长及其存活率具有强烈的不利影响（p<0.05，Kruskal-Wallis Dunn post hoc test ），而与细菌群落（BO，BF）相结合，植物生长可以恢复到与无微生物群落处理（MF）的对照植株类似的水平（图4A）。与对照植株MF相比，增加微生物聚生体（BFO）的复杂性可以显著促进植物生长。与前述假设一致（即细菌限制真菌和卵菌在土壤-根连续体的生长），细菌群落的存在显著降低了基质中这些微生物群落的α多样性（Kruskal-Wallis with Dunn’s post hoc test, p < 0.05)(图4B和S4A)。值得注意的是，在存在丝状真核微生物（B与BF，BO，BFO）的情况下，细菌群落的分类结构基本保持不变，而在细菌群落存在的情况下观察到明显的真菌和卵菌群落变化(F，FO与BF，BFO/O，FO与BO，BFO)。 置换多元方差分析（PERMANOVA）表明，真菌和卵菌群落结构的11.6％和7.8％的变异可以用添加了细菌来解释，而丝状真核生物仅解释了细菌结构变异的2.20%至3.65%（P < 0.05）。研究结果表明，细菌介导的真菌和卵菌群落变化可以影响植物生长的恢复，并表明根系微生物细菌的主要生理功能是保护植物免受根源丝状真核生物的危害。 图3. 根源真菌和卵菌培养物集合的回收率和分类学表征（A）培养依赖性和非培养依赖性两种方法下的真菌（上图）和卵菌（下图）分类组成的比较。培养物收集：从CAS和三个天然位点Pulheim，Geyen和Saint-Die’中分离的植物根中分离的69种真菌和11种卵菌菌株的分类组成（类别水平）（图S3A和S3B）。非培养依赖性：在用于培养依赖性方法的相同土壤中生长的拟南芥根系检测到的真菌和卵菌根系OTU的分类组成（在至少一个位点上相对丰度> 0.1%，RDP物种类别注释置信度阈值为0.8)。（B）在不同阈值下来自培养物收集物的真菌（上图）和卵菌（下图）分离物的回收率。等级丰度图显示了在上述土壤类型中生长的拟南芥中50个最丰富的与根系真菌和卵菌OTU以及它们的累积相对丰度。在培养物收集物中具有代表性分离物的OTU（97%序列相似性）用黑色柱状表示。对于代表总读数的60%和80%的OTU，给出回收的纯培养物的天然存在的OTU的百分比。 4 细菌生物活性的冗余分析 将单独的真菌分离株在无菌FlowPot系统进行重新定殖实验表明，从健康的拟南芥中分离出的18/34根源真菌限制了宿主植物生长，而16/34真菌菌株对植物生长没有显著影响（p<0.01，Kruskal-Wallis Dunn post hoc test）（图S3C）。微生物群落重组实验表明只有一部分对植物生长有害的真菌菌株（6/18）的丰度在细菌存在的情况下存在明显的降低，表明根系的细菌共生体不能选择性的限制有害根系真菌的生长（基质样品，图S3C和S4E）。将106个上述的根系共生细菌和进化多样菌种库中的27个真菌（其中包括微生物重组实验中的7个真菌）互作组合，以三次重复检查了2862个双元互作，鉴定到了明确的系统发育信号，包括一些丛毛单胞菌科的细菌株系(Comamonadaceae)，假单胞菌的细菌株系(Pseudomonadaceae)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)的细菌株系，黄杆菌科(Flavobacteriaceae)的细菌株系，表现出强的竞争潜力。因此，一些细菌类的根系微生物分类谱系可以针对广谱拟南芥根系的真菌发挥直接的活性抑制作用。通过SparCC网络分析，对鉴定的天然位点样品中的相关性强度与在高通量真菌-细菌相互作用筛选中确定的相互作用表型进行比较，揭示了大多数测试的细菌谱系的一致趋势并且鉴定了贪噬菌属(Variovorax)和食酸菌属(Acidovorax)菌株、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)可作为有前景的生物防治微生物(图S5D-S5F)。这表明根系细菌共生体的直接抗真菌活性是影响生长在自然界的植物根系多界微生物群落中细菌和真菌OTU之间高度负相关的重要决定因素。 从完整的细菌群体中除去最具有竞争力的属于假单胞菌科（-P，8个成员）和/或丛毛单胞菌科（-C，10个成员）的细菌，在无菌的拟南芥上重新定殖了真菌群落，培养基中包含所有或者3个扰动的细菌群落（BF or BF-C, BF-P, BF-C-P）（图5B）。结果表明缺乏这两个科的细菌群落在包含真菌群落的人工合成群落中依然能保护植物生长，但是与空白对照相比不能完全恢复植物生长（图5B）。这些结果表明假单胞杆菌科和丛毛单胞菌科的根部共生细菌可能有助于植物生长恢复，也表明在没有这些科的菌株成员的情况下，来自其他分类学谱系的菌株也有助于保护拟南芥。总之，利用天然取样点采集的样本，通过基于网络的方法预测根系微生物群落跨界连通性、二元真菌-细菌互作实验和无菌植物的群落扰动实验表明，根系细菌微生物群落导致的保护活性是由几种细菌谱系介导的多重性状。 图4 拟南芥根系多界微生物重建。(A) 在FlowPot系统中，使用根源细菌(148)，真菌(34)和卵菌(8)分离株对无菌植物进行重新定殖。接种细菌(B)；真菌(F)； 卵菌(O)；细菌和卵菌(BO)；细菌和真菌(BF)；真菌和卵菌（FO）以及细菌、真菌和卵菌（BFO）4周后的拟南芥Col-0的鲜重。MF表示无微生物/对照。 将鲜重重量值与MF进行标准化。 用字母表示显著差异（p <0.05，Kruskal-Wallis Dunn post hoc）。 存活率值表示存活的发芽植物的百分比。数据来自三个生物学重复（由不同形状表示），其中每个包含三个技术重复。(B) 对于每种上述接种样品中，观察到的微生物组物种数量（p <0.05，Kruskal Wallis with Dunn’s post hoc test）。 输入，初始微生物接种物; UNPL，未种植的基质。（C）4周后初始输入、输出的基质和根样品中的微生物分离物的相对丰度。分类水平分别为细菌的门水平，真菌和卵菌的种水平。括号中的数字分别代表在B，BF或BFO条件下，F，BF或BFO条件下，或O，BO或BFO条件下特异性富集基质样品的细菌，见图S4E。 图5.细菌根系微生物群落对根系真菌活性的抑制（A）与系统发育上不同的菌根共生体相互作用后真菌生长的变化图。 热图描绘了真菌相对生长指数log2（存在细菌竞争因子/不存在细菌竞争因子），使用具有小麦胚芽凝集素（WGA），Alexa Fluor 488配合物的几丁质结合测定法通过荧光测量。基于完整的细菌16S rRNA基因序列构建系统发育树，引导值用黑色圆圈表示。垂直和水平条形图分别表示每种细菌菌株的累积拮抗活性和每种真菌分离物的累积敏感性得分。白色和黑色交替用于区分不同科水平的细菌。所有细菌和7/27真菌（粗体突出显示）用于上述微生物群落重组实验（见图4）（B）相对于不含微生物的对照植物，仅接种真菌（F）或细菌加真菌（BF，BF-C，BF-P，BF-C-P）后植物的鲜重。-C，去掉丛毛单胞菌科菌株; -P，去掉假单胞菌科菌株。用字母表示差异显著性（Kruskal-Wallis与Dunn post hoc tets，p <0.05）。 对于每种菌株，显示仅接种细菌的对照植物的相对鲜重（蓝色垂直线;标准误差，n=8）。灰色水平虚线表示不含微生物的植物的鲜重，标准化为1。（C）与（B）中的实验相同，但不是去除细菌菌株，而是将单个细菌分离物与包含34个成员的真菌群落（F）共同接种以确定它们对植物生长恢复的影响。 讨 论 细菌、真菌、卵菌分别起源于35、10.5、5亿万年前，可能在大约4.5亿万年前，植物在陆地上生长之前，土壤中这几种微生物群落就共同存在、互相作用(Hassani et al., 2018)。这些微生物群体之间可能存在包括根分泌的光合作用产物在内的土壤有机质竞争 (Zhalnina et al., 2018)，这也解释了本文的试验结果（解释：土壤微生物数量，尤其是土壤细菌的丰富度与土壤磷酸单酯酶、β-葡聚糖酶、脱氢酶和水解酶等酶活性呈显著正相关。土壤酶主要来源于土壤微生物和植物根系的分泌物及动植物残体分解释放的酶等。换句话说，微生物丰度与来源于植物根系分泌的各种土壤酶类的活性正相关），即在每个微生物界内部正相关占据主导地位，而在细菌和丝状真核生物界间则以负相关为主。在我们的植物系统中，根系细菌对真菌和卵菌群落结构（分别解释了> 7％和> 10％的方差）的显著影响一定程度上说明了自然环境中存在着促进植物生存的的微生物界之间的相互作用。鉴于拟南芥根系真菌和卵菌群落存在很强的生物地理信号，也可能受其扩散限制和/或气候的影响(Coleman-Derr et al.,2016; Talbot et al., 2014)，我们提出，根系细菌共生体对系统发育不相关的真菌的生物防治活性有助于保护植物生长。属于贪噬菌属和假单胞菌属的细菌分离物对宿主有很强的保护作用，是根系微生物群的核心成员(Hacquard et al., 2015)，并且占三个天然采样位点的拟南芥根中检测到的16S rRNA读数的24%。我们观察到，属于根系细菌微生物群落的不同分类谱系的单个细菌菌株足以保护植物宿主免受分类学上多样化的根系定殖真菌的影响，这至少为解释农田中使用的一部分生物防治细菌提供了一个合理的框架。 鉴于所有试验的微生物都是从植物根部分离出来的，在基质中检测到的根系微生物之间的竞争表明植物根系中可能也存在微生物界之间的竞争。这可能可以解释为什么在微生物群落重组系统中，接种细菌会改变基质和根样本中真菌和卵菌的群落特征（图4C）。由于缺乏未种植植物的土壤上的整体微生物培养物，我们无法断定从少量细菌土壤生物群落水平中获得的根系细菌微生物群(Bulgarelli et al., 2012; Lundberg et al., 2012)是否更为富集限制丝状真核生物在根定殖的菌株。然而，我们基于网络进行的微生物界间的互作分析间接支持了这一假说，其中原核生物和丝状真核微生物的负相关与正相关的比率从土壤网络中的4：1变为根内网络的12:1(图2B和图S2C)。综上这些结果表明，研究检测到的微生物界间的相互作用发生于微生物建立时期的土壤-根连续体，并且后续在植物根内部得以维持。 研究中所使用的所有细菌、真菌、卵菌株系都是从健康的拟南芥根部植株中分离出来的，但是包含了细菌和丝状真核生物的合成群落对植物健康的影响效果却大不相同。已有研究表明去除了菌根共生体对拟南芥或其亲属植物造成的影响能够被部分有益的根内生真菌所补偿(Almario et al.,2017; Hiruma et al., 2016; Hacquard et al., 2016)。我们的数据显示，天然种植的拟南芥根部拥有丰富多样的丝状真核生物，以子囊菌为主，但也表明在没有细菌竞争者的情况下，根系丝状真核生物（F，O，FO）的聚集体对植物健康和存活有害。>50%的真菌分离株与植物宿主单一结合时限制植物生长，这与早期的报道一致(Keim et al., 2014; Kia et al., 2017)，也表明了许多拟南芥根系真菌和卵菌可能存在的有害作用不能仅依靠植物先天免疫系统控制。然而，最复杂的多界微生物聚生体（BFO）重新定殖于拟南芥，在无菌植物系统中表现出最大植物生长速率和存活率。因此，我们提出，作用于植物宿主及其相关微生物群的相互选择压力，在时间进化尺度上，有利于微生物界-微生物界之间的互作，而不是与单一微生物纲相关联。
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