【原】科研 | 中科院白洋等：拟南芥三萜化合物调控根系微生物（IF: 41.058）

微生态 2021-04-13

展开全文

本文由xq_ing编译，董小橙、江舜尧编辑。

原创微文，欢迎转发转载。

导读

在自然界中，植物的“生老病死”和“饱食暖衣”不仅和所处环境密切相关，也和种类繁多的根系微生物紧密联系。据估计，植物将~20%光合产物用于根系化合物的合成，但这些化合物是否参与植物与根系微生物的互作过程，是否直接调控特异种类的根系微生物，这些问题尚不清楚。该研究作者在拟南芥根中发现了三萜生物合成网络。他们解析了拟南芥三萜thalianin 、TFAEs和arabidin的合成途径，通过基因共表达特性寻找到新的参与三萜合成的基因，鉴定合成过程中生成的中间产物和终产物，最终证实三萜合成途径会影响拟南芥根系微生物组。用纯化的化合物进行的体外生物测定揭示了代谢物对根系微生物的选择性生长调节及其对细菌的生化转化和利用，进一步支持该生物合成网络在形成拟南芥特异性根系微生物群落中的作用。

论文ID

原名：A specialized metabolic network selectively modulates Arabidopsis root microbiota

译名：一个特有的代谢网络选择性地调控拟南芥根系微生物

期刊：Science

IF：41.058

发表时间：2019年5月

通信作者：白洋& Anne Osbourn

通信作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所& 英国约翰英纳斯中心

实验方法

植物材料

本研究以拟南芥Col-0为野生型。除另有说明外，所有拟南芥T-DNA插入突变体均来自NASC。利用表S5A中列出的引物进行PCR基因分型鉴定纯合突变体。

克隆和瞬时表达

THAS、THAH、THAO、THAA1、和THAA2、THAR1、THAR2、THAA3、ABDS、CYP705A1、At1g14960、At5g23840、At2g16005、At5g38030、At1g50560、At5g38020，MRO、CYP705A12、MRN、At5g12420、At5g55380、At3g49210、At1g54570、At3g49190、At3g26840的编码序列从Col-0根cDNA文库扩增而来。先前已经克隆了来自燕麦的PEN3、CYP716A1和tHMGR基因的编码序列。从NCBI检索Cuphea palustris中CpFatB2的编码序列，并由IDT合成。将这些序列克隆到pEAQ-HT表达载体中，在烟草叶中瞬时表达，如补充材料中所详述。

代谢物的提取和分析

在浸染5天后通过瞬时表达实验，采集烟草叶，冻干，用EtOAc萃取并通过GC-MS分析。将拟南芥Col-0和突变体、水稻和小麦的幼苗在1/4 MS琼脂培养基上在短日照条件下生长10天，分别取根、完整幼苗和剩余培养基，冻干，用EtOAc萃取并通过GC-MS分析，用MeOH萃取并通过LC-MS分析。使用Agilent MassHunter和XC-MS分别进行靶向和非靶向代谢组学分析GC-MS和LC-MS数据。

Thalianol 和arabidiol衍生物的产生和分离

通过对具有相应表达构建体的农杆菌LBA4404菌株对烟草叶进行大规模真空渗透，随后提取和纯化，获得T1-T10,3-keto-T2,T17,cis-T10,cis -T17,A1,A2和A4化合物。由相应的前体通过化学手段合成3-keto-T1,T11,T18a-c,A3和A5化合物。

微生物组分析

Col-0和三萜突变体在受控的短日照条件下在昌平农场种植(40°5'49''N，116°24'44''E，中国北京)。两种小麦(Xiaoyan54和Jing411)和水稻(IR24和Nipponbare)分别于2016年和2017年在昌平农场种植。在种植后6周，取拟南芥、小麦和水稻的根样，用于16S rRNA扩增子分析。用QIIME1.9.1、USEARCH10.0和自写脚本进行数据分析。具有差异丰度的OTU在edgeR包中用负二项式广义线性模型识别，倍数变化阈值> 1.2。使用Venndiagram软件包生成维恩图。

体外生物制剂

从Col-0中分离并鉴定了根相关细菌，选择来自不同分类群的19种细菌分离物，用于生物测定。在TSB培养基中将细菌与三萜混合物或单个三萜的不同配制混合物共培养，并在48-72小时内监测它们的生长。针对所有19种细菌测试细菌介导的三萜类T1、T11、T18a向T18c的转化，而针对敏感细菌菌株A224、A475-1、A479测试T2、T9和T10。

实验内容

三萜类化合物是植物中种类最多、结构最为多样的一类次生代谢物，在植物防御、信号转导等方面发挥重要功能，同时具有抗菌活力，这表明它们在调节植物和微生物间的相互作用中具有潜在作用。三萜类化合物通过甲羟戊酸途径合成，第一个特定步骤由三萜合酶(TTS)进行，这些酶能够合成多种不同的三萜类骨架。在拟南芥(Col-0)基因组中预测了13个TTS基因，其中5个基因(MRN，THAS，ABDS，PEN3和BARS)在四个生物合成基因簇上，定位于第4号条染色体和第5号染色体上(图1A)。

植物生物合成基因簇有着编码具有生态重要性的代谢物的潜力。这四个拟南芥生物合成基因簇中的大多数基因在根中表达(图1B)，并且arabidiol基因簇与根腐病病原体Pythium irregulare有关，这表明衍生的代谢物可能在根-微生物相互作用中起着重要作用。拟南芥生物合成基因簇的TTSs似乎具有共同的祖先，但功能上的有所不同(图S1)。这些聚集的TTSs通过将普遍存在的前体2,3-氧化角鲨烯转化为不同的三萜骨架，特别是marneral/marnerol M1/M2，thalianol T1，arabidiol A1，tirucalladienol Tr1和baruol B1，通过相应的双/三/四环碳阳离子将初级代谢物转化为特有代谢物。先前已表明这些基因簇中的13个细胞色素P450(CYP)基因中的4个基因将T1,A1,M1/M2和Tr1转化为3β,7β-thaliandiol T2,14- apoarabidiol A2,23 hydroxy-marner-al/ol M3/M4和未知产物(图2)。然而，在这些生物合成基因簇中存在许多未表征的基因，并且与拟南芥根中表征的TTS和CYP基因共表达(图1B和图S2)。在此，我们阐明了来自thalianol和arabidiol基因簇的三种生物合成途径，表明这些主要的根系代谢产物在体内和体外选择性调节拟南芥根细菌中起着重要的作用，并为拟南芥特有的根系微生物组的建立做出了重要贡献。

图1. 鉴定拟南芥中根表达的三萜生物合成网络

阐明thalianol基因簇衍生的途径

拟南芥生物合成基因簇包含四个共表达基因，其中两个基因(THAS和THAH)的功能已被表征。属于CYP705家族的第二个CYP介导该途径的第三步，但尚未确定所得产物的结构。其他途径基因共表达的第四个基因(THAA1)编码属于BAHD家族的酰基转移酶，但其功能未知。我们在烟草叶中使用农杆菌介导的瞬时表达来研究簇基因THAO和THAA1的功能。我们首先以组合的方式在烟草叶中共表达THAS与其他三个编码羟化酶(THAH)，CYP705A5(THAO)和酰基转移酶(THAA1)的簇基因(表S1)。我们发现当与THAS共表达时，THAO单独可以修饰thalianol，产生两种新产物3β,16- thaliandiol T3和16-keto-thalianol T4(图2和图S3)。此外，我们发现THAA1编码的酰基转移酶仅在与THAS，THAH和THAO三个基因共表达时才具有功能，产生一种新产物，鉴定为3β,7β-二羟基-16-酮-thalian-15-基乙酸盐T7(图2和图S3)。

这表明THAA1在THAS,THAH和THAO之后起作用，在thalianol骨架的C15位置上添加乙酸酯基团。我们还鉴定了另一种BAHD酰基转移酶基因(THAA2，At5g47950)，该基因与第5号染色体上的THAA1非常接近，与thalianol簇基因共表达(图1)。THAA2与thalianol簇基因的子集共表达时，它可以作用于不同的thalianol衍生化合物(T1-T7)的C3羟基部分以引入乙酰基(图2;图S4;表S1)。我们的结果表明，四种拟南芥簇基因和共表达基因THAA2是有功能的，并且在烟草中共表达时产生7β-羟基-16-酮-thalian-3β-15-基二乙酸酯T17。

图2. 拟南芥根中的三萜生物合成网络

鉴定拟南芥中thalianol衍生的根代谢物

我们进行了靶向代谢组学分析，鉴定拟南芥中thalianol衍生的代谢物。代谢谱分析鉴定了来自Col-0和THAS过表达株系(thas-oe)的根提取物中的七种主要的thalianol衍生产物(T1,T2,T9,T10,T18a-T18c)，这些在THAS突变体中不存在(图3 A-C;表S2)。THAH突变导致T3和T4的积累，而THAO的突变导致T2的水平升高和T3、T4的缺失(图3 A,B;图S5)，表明THAO在拟南芥中作为thalianol的C16氧化酶起作用。我们无法在Col-0或thas-oe根提取物中检测到T5-T7和T17，但我们检测到T7和T17的潜在异构体T9和T10(图S5)。在所有thalianol簇基因和THAA2突变体的根提取物中不存在T10，而在thaa2-ko和thaa2-crispr中可检测到T9，表明T9和T10是thalianol基因簇下游产物，THAA2在T9后起作用以形成T10(图3 A-C;图S5)。靶向代谢组学分析还显示，在Col-0和thas-oe根的提取物中存在thalianol衍生的中链饱和三萜烯脂肪酸酯(TFAEs)，包括棕榈酸棕榈酸酯(16:0,T18a)，肉豆蔻酸酯(14: 0,T18b)和月桂酸(12:0,T18c)(图3 A,B)。化合物T18a和T18b也在其他突变体系thah-ko,thao-ko,thaa1-crispr,thaa2-ko和thaa2-crispr的根中检测到，表明存在thalianol-衍生的生物合成途径的支链。通过化学合成证实了这些TFAEs的身份。

图3. 不同拟南芥品系根系代谢产物分析

鉴定thalianin、TFAEs和arabidin生物合成的缺失基因

为了鉴定代谢物T9和T10生物合成的缺失基因，我们使用四种thalianol簇基因在ATTED-II植物共表达数据库中对共表达的候选生物合成基因进行全基因组搜索。我们在排名前20的共表达基因中选择了8个在烟草中进行功能分析(表S2)。我们鉴定了两个基因At3g29250(THAR1)和At1g66800(THAR2)，它们编码一对能够将T1-T7的C3羟基部分差向异构化的氧化还原酶(图1 A,B;图2;图S6)。在该差向异构化序列中，THAR1将T1的C3β羟基转化为T7C3酮，而THAR2依次将C3-酮还原成3α醇(图2;图S6;表S9)。THAR1、THAR2与thalianol簇基因和THAA2的共表达完成了烟草中T10的生物合成(图S7)。通过核磁共振将T10确立为7β-hydroxy-16-ketothalian-3a-15-yl diacetate。

为了鉴定负责TFAEs T18a-T18c生物合成的基因，我们筛选了基于拟南芥注释中的7个O-酰基转移酶基因，发现当共表达时，这些基因中只有一个可催化形成T18a。我们用THAA3过表达株系(thaa3-oe)发现THAA3可以催化植物中T18a的形成，因为在该品系中检测到T18a水平升高，而T18b和T18c没有检测到。THAA3可能是部分冗余的，因为在THAA3突变体(thaa3-ko)中仍检测到T18a(图S8 C,D)。我们进一步表明THAA3可以在与THAS共表达时催化T18b的形成，并且表明还有尚未鉴定的基因参与TFAE(T18a-T18c)生物合成。除了thalianol之外，THAA3还可以作用于其他三萜(包括arabidiol A1及其衍生物A2，PEN3产物Tr1和marnerol M2)，以根据可获得的脂肪酰基CoA的类型引入棕榈基或肉豆蔻基(图S9)。然而，这些产物在拟南芥Col-0或thaa3-oe根中未检测到，可能是因为它们的丰度非常低。

非簇基因(包括THAR1,THAR2和THAA2)编码的酶具有杂乱性，并且它们与根中其他三萜基因簇有很强的共表达(图1B,2),所以我们使用这些基因与arabidiol，marneral和tirucalladienol簇TTS和CYP基因在烟草中进行组合生物合成实验。我们的结果显示，THAR1、THAR2和THAA2也可以作用于arabidiol A1,14-apoarabidiol A2和tirucalladienol Tr1(图S10,S11)，但不能作用于marnerol M2。当THAR1，THAR2和THAA2与ABDS和CYP705A1共表达时，arabidiol A1完全转化为A5(图2,图S12)。A5是通过对Col-0与ABDS和CYP705A1突变体的比较代谢组学分析鉴定的拟南芥根代谢物。

拟南芥T-DNA插入突变体THAR1(thar1-ko)、THAR2(thar2-ko)和THAA2(thaa2-ko)的根提取物的代谢物分析证实这三种基因确实是合成thalianin T10所必需的。在三种突变基因型的根提取物中不存在T10，并且分别积累T7和T17，T8和T9(图S13)。此外，THAR2和THAA2也负责14-apo-arabi-3a-yl acetate A5的生物合成，因为突变体thar2-ko和thaa2-ko缺乏A5，以积累A3和A4代替(图S14)。在thar1-ko根提取物中检测到A5，表明THAR1在14-apo-arabi-3a-yl acetate A5生物合成中是部分冗余的。因此，这些酶参与多种途径。

三萜生物合成影响拟南芥根系微生物组

在烟草中发现并重建了thalianin T10，arabidin A5和TFAEs T18a,T18b的完整生物合成途径后，我们试图研究这种代谢网络的生物学作用。thalianin T10和arabidin A5途径中的基因分别在拟南芥根表皮和中柱鞘/中柱中表达(图S15)，

在根表面提取物中可以检测到thalianol合成途径中的T1，T2，T9，T10和arabidin A5，T9和T10也可以在水培生长的幼苗的渗出物中检测到。并且在根表面可检测到thalianol途径化合物T1，T2，T9，T10和arabidin A5，T9和T10也可以在水培的幼苗分泌物中检测到(图3 D,E;图S16)。此外，在茉莉酸甲酯处理中，thalianin和arabidin途径的基因都上调(图S17)，表明它们可能在与根系微生物的相互作用中发挥作用。

我们选择在thalianin(T10)，TFAE(T18a-T18c)和arabidin(A5)途径中被破坏的突变体和野生型(Col-0)，分析根系微生物组(表S2)。对这些突变体和Col-0的根提取物、根表面提取物和根系分泌物进行全面无偏的非靶向代谢组学分析，表明thalianin途径化合物是所有根代谢物中受影响最大的。在受控的实验条件下，将这些品系在北京昌平农场的天然土壤中种植6周，收获根并用PBS缓冲液洗涤以除去附着的微生物，然后使用先前建立的方法对根系微生物进行16S rRNA扩增子测序。当收获植物时，野生型和突变体之间的根表型没有明显差异。然而，与野生型相比，在这些途径中受影响的突变体富集了不同的根系微生物。CPCoA分析揭示了野生型和突变体之间根系微生物群的差异(图4A;表S18-S22)。THAS(thas-ko1和thas-ko2)和THAA2(thaa2-ko和thaa2-cripsr)的突变体各自显示相似的代谢物缺陷，并具有相似的微生物群特征和微生物多样性。(图4A)。此外，突变体和野生型相比，在门和OUT的分类水平上，显示类似Bacteroidetes(富集)和Deltaproteobacteria(消耗)的根系微生物调节模式(图4B)，这些基因与thalianin生物合成的相同途径一致。数据表明，我们揭示的三萜生物合成网络有助于根系微生物建立。

为了解这些代谢网络是否调节拟南芥特异性根际细菌，将Col-0和突变体的根际细菌特征与水稻和小麦的根际细菌特征进行比较。虽然拟南芥、水稻和小麦的样品在许多因素存在差异，包括生长条件、发芽期和气候条件，但起始接种物非常相似，有大量OTU重叠。我们发现，与水稻和小麦相比，拟南芥Col-0根系特异富集494个OTU(图4)。与拟南芥不同，水稻和小麦不产生thalianin，TFAEs或arabidin。结果表明，我们发现的三萜生物合成网络可能有助于富集野生型根系中存在的约三分之一根际细菌(图4C)，同时阻遏了其他18％的细菌种群(图4D)。结果表明这种三萜生物合成网络可能在丰富拟南芥特有的根细菌而不是排斥其他细菌方面发挥更重要的作用。

图4. 三萜合成途径突变体特定的根际细菌分类群的调节

纯化的三萜选择性地调节根细菌

为了验证三萜途径代谢物是否直接调节根系微生物，我们从种植在昌平农场土壤中的Col-0的根中分离和鉴定细菌。我们在三种主要的细菌门(Proteobacteria，Actinobacteria和Firmicutes)中选择了19种(17属)菌株。这些菌株在液体培养基中生长，其中配制的混合物反映了Col-0根中化合物合成途径代谢物的含量和组成。我们发现，在拟南芥三萜混合物存在下，大多数Proteobacteria菌株增殖更快，而所有Actinobacteria菌株都被抑制(图5A)。对应于这些细菌分离物的OUT，显示植物根部与土壤中的浓度和消耗模式一致，这与三萜混合物的生长促进和抑制作用相对应，表明所试验的化合物有助于植物根际细菌的主动选择。此外，在我们分析的至少一个突变体的微生物群中发现了10个代谢敏感细菌属的相应富集或耗竭模式，三萜混合物促进或抑制生长的细菌属与野生型相比，在突变体中分别被耗尽或富集。用纯化的单个化合物对敏感菌株进一步试验，表明合成途径中代谢物可以选择性地调节细菌的生长，并且化合物之间的小的结构差异会影响活性。例如，我们发现Actinobacteria Arthrobacter sp.菌株A224被20mM的T2，T9，T10和A5化合物抑制，但是被其他三萜类化合物抑制，而所有试验的化合物显示出对GammaproteobacteiraArenimonassp菌株A388的生长促进作用(图5 B,C)。

图5. 三萜合成途径代谢物对分离的拟南芥根相关细菌的生长和细菌介导的化学转化的影响

我们还发现菌株A475-1具有醇脱氢酶活性，并且可以选择性地将T2转化为3-keto-T2，但不转化为T9/T10(图6 A,B)，而菌株A215具有脂肪酶活性，能够裂解TFAEs T18a-T18c，得到T1和相应的脂肪酸而不是乙酸盐T11(图6 C,D)。此外，菌株A215可以用裂解产物棕榈酸作为增殖的碳源(图6E)。根代谢物与不同的根系微生物成员的这种多样且实质的相互作用模式，表明来自该生物合成网络的代谢物改变了拟南芥根系微生物组成。将根系微生物组测序和体外生物测定的结果结合，认为这种三萜生物合成网络调整生态位，用于组装和维持拟南芥根生物群。结合根系微生物组测序和离体生物测定的结果，我们认为三萜生物合成网络调整了拟南芥根系微生物组成。

图6. 细菌介导的三萜转化

结论

这里描述的三萜生物合成网络具有合成超过50种根代谢物的潜在能力(图2)。在本实验条件下，我们检测到的极性甲醇和非极性乙酸乙酯提取物中约有300种非挥发性根代谢物，这是一个相对较大的数目。该网络起源于进化趋异的生物合成基因簇，这些酶由为多种生物合成途径所需的外围基因编码。这些根系代谢物可作为抗生素或增殖剂，选择性地调节拟南芥不同类群的根系细菌的生长。这些特化的根系三萜类物质的生物合成动态地调节了拟南芥大部分的特有细菌(图4 C,D)，从而形成拟南芥特异性根系微生物群。三萜是一种庞大而多样的植物天然产物(目前已报道> 20,000种)，它可能还会调控其他植物物种的微生物组，以产生植物物种特有的微生物群落，并可能有助于为可持续农业建造根系微生物组。人们很容易想到，植物界的代谢多样化可能为交流和识别提供基础，从而能够根据宿主的需要形成特定的微生物组，这可能在一定程度上解释了植物专有化代谢的存在。

三萜类化合物是植物中一类庞大而多样的次生代谢物，在植物防御、信号转导等方面发挥重要功能，同时具有抗菌活力。该研究系统地解析并重构了拟南芥根特异表达的三类不同三萜化合物的基因网络。催化形成三萜化合物不同步骤的合成基因在基因组中形成基因簇，这些基因簇功能缺失突变体与野生型植物相比根际微生物组的种类和多样性明显发生变化。通过与不能合成这些三萜的水稻和小麦的比较研究，揭示了拟南芥三萜合成的基因网络能够富集拟南芥特异性的根际微生物组。通过分离培养的根际微生物资源库与纯化或合成的单种或多种混合化合物进行共培养，结果发现这些三萜化合物直接调控特异的根系细菌种类。这为解析根际微生物对植物生长和健康的影响、利用植物天然化合物促进根系益生菌在绿色农业中的应用提供了理论依据。

你可能还喜欢