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编译：仰望星空，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：Gut microbiome and cancer immunotherapy 译名：肠道菌群与肿瘤免疫治疗 期刊：Cancer Letters IF：6.508 发表时间：2019.04 通讯作者：李伟娜&张鹏 作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院 主要内容 人类微生物生态系统在人类健康和疾病中起着重要作用。人类微生物群由各种微生物组成，如细菌、真菌、古细菌、原生动物和病毒等，它们存在于我们身体的上皮屏障表面。肠道微生物群中含有约3×1013种细菌，其中大部分与宿主共生。微生物群可影响多种生理功能，特别是代谢、炎症和免疫。当肠道微生态系统发生变化时，一些共生细菌可以迅速增殖并获得致病特征，包括艰难梭菌或万古霉素耐药肠球菌。肠道菌群与上皮细胞和基质细胞相互作用，发挥各种重要的调节功能。例如，它可以调节屏障功能，维持粘膜免疫稳态和宿主微生物共生，防止病原体感染，控制病理生物的过度生长，调节代谢，包括维生素合成和不可消化膳食纤维的代谢。因此，健康的身体离不开具有特定功能的完整肠上皮，肠道菌群、免疫细胞和粘膜屏障共同维持肠上皮的稳态。 肿瘤免疫治疗已成为治疗肿瘤患者的一种新兴方式。它利用免疫系统发挥抗肿瘤的作用。免疫检查点抑制剂（ICIS）作为一种新型的免疫治疗药物，在晚期血液恶性肿瘤中取得了很好的临床治疗效果，单克隆抗体（mAbs）阻断细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡1配体1（PD-1/PD-L1）。然而，有一些患者在治疗过程中出现了原发性或获得性耐药，阻碍了ICIS的广泛临床应用。鉴于此，选择最佳的候选患者是避免耐药性和提高ICIS疗效的关键。此外，许多关于克服免疫治疗的耐药的相关研究也正在进行中。 越来越多的文献报道肠道菌群在肿瘤治疗中发挥重要作用。肠道微生物成分对外周免疫系统有深刻的影响，包括在肿瘤相关的免疫。最近的研究表明，肠道菌群影响ICIS对肿瘤的治疗效果。值得注意的是，肠道菌群的破坏（被称为“肠道菌群失调”）一直在流行病学上与各种慢性炎症疾病有关。在此，我们讨论了肠道菌群、肿瘤、免疫和肿瘤免疫疗法之间的关系，重点是免疫疗法。同时，我们简要介绍了影响免疫治疗的疗效的相关挑战，并提出了可能的解决方案。 1 微生物群与肿瘤 所有与宿主相关的微生物都是在出生后通过垂直传播获得的，然后通过整个生命中的环境暴露而继续进化。肠道菌群在天然免疫和获得性免疫反应中起着至关重要的作用。肠道菌群可以实现调控炎症、感染、食物和共生抗原耐受之间的微妙平衡。除了对局部免疫生理学的影响外，肠道菌群在整个有机体中起着全身性的作用。例如，与野生自由生存的动物相比，在特定无病原体(SPF)条件下饲养的实验小鼠缺乏促进宿主健康的关键特性。鉴于此，通过将野生型小鼠肠道菌群转移到实验小鼠身上，可以产生长时间的免疫调节作用，即使经过几代繁殖，这种效应仍然存在。因此，它有利于抗病毒感染以及致突变和炎症引起的癌变。 已经发现，微生物群与上皮屏障和无菌组织中多种肿瘤类型的发生和发展密切相关。微生物栖息在肠道或其他粘膜中，在局部和远处癌变过程中发挥作用： ①一方面，微生物群可以作为肿瘤转化剂直接提供有毒代谢物或致癌产品。 ②另一方面，它通过诱导炎症或免疫抑制而间接地在促进癌症中发挥作用。 ③此外，通过粪菌移植(FMT)，可以将无免疫相关基因(如Tbx 21、Nod2、Nlrp6或TLR5)的基因敲除小鼠的“容易发生肿瘤”的特点转移到其他正常小鼠中。 ④同时，也有越来越多的证据表明，细菌通过增强宿主的抗肿瘤免疫力，在对抗远离肠道的肿瘤也发挥着积极的作用。 相关研究也表明抗生素的使用与癌症风险之间存在剂量依赖关系。此外，对于无菌小鼠(GF)和无特异性免疫增强细菌物种的小鼠以及使用了广谱抗生素的小鼠，抗肿瘤治疗的效果都有所减弱。治疗效果有限是由于肠道菌群的缺失或菌群的调控所致。菌群提高抗肿瘤免疫应答的精细机制可根据治疗方式而变化。例如，环磷酰胺导致小肠的易位-在结肠中存在着肠球菌，并在结肠中积累了巴氏杆菌，这两者都有助于在抗肿瘤免疫中发挥协调的免疫刺激。这归因于上端胃肠道的渗透性增加。为了证实这些实验结果，在转移性肺、肾和膀胱癌患者队列中进行独立回顾性分析显示，抗生素在靶向PD1/PD-L1的单抗治疗中发挥了“有害作用”。此外，肠道细菌在血液学恶性肿瘤中调节了异基因造血干细胞移植（ASCT）后感染和移植物抗宿主病（GVHD）的风险。早期应用全身广谱抗生素与GVHD和移植相关死亡率的增加相关，可能是在肠道菌群中保护性Clostridiales andBlautia菌的耗竭有关。 总之，所有这些研究都为识别具有抗癌活性的“好菌”提供了依据。 2 肠道结构、微生物群和免疫 人类体内存在着数以万亿计的微生物。在发育过程中，微生物在身体的许多部位，如皮肤和粘膜表面，不断地与宿主相互作用(图1)。因此，可以想象微生物在宿主功能中发挥着各种极其重要的作用，包括免疫功能。 肠粘膜包括由肠上皮细胞(IECs)和上皮内淋巴细胞组成的单上皮细胞层(图1)。这种独特的结构促进了与免疫系统的相互作用。Paneth细胞和杯状细胞分别位于IECs中，分泌抗微生物肽和粘液，进一步覆盖上皮。固有层是位于粘膜层下面的结缔组织层，并且含有Peyer's斑和各种免疫细胞，例如抗原呈递细胞(APCs)、先天淋巴细胞、T和B细胞。肠相关淋巴组织是体内免疫系统的最大组成部分的典型代表，在局部和全身免疫反应中起重要作用。 模式识别受体介导的病原体相关分子模式识别(PAMPs)促进了局部免疫。模式识别受体(PRRs)包括IECs上的Toll样受体(TLRs)和肠道内的天然免疫效应器，而PAMPs则含有脂多糖和鞭毛素。此外，局部免疫反应可能受到细菌产生的代谢产物的影响，主要是通过产生短链脂肪酸(SCFAs)。已经证明，SCFAs在许多关键的活动中可以通过浆细胞产生IgA来增强免疫。IgA不仅通过阻断细菌与上皮细胞的粘附作用，而且还直接影响细菌的毒力。 肠的引流淋巴结位于小肠和结肠的肠系膜中，称为肠系膜淋巴结(mLNs)。在mLNs内，共生菌转化获得性免疫应答，然后影响幼稚T细胞的分化。PAMPs用于诱导包括树突细胞(DCs)的APCs的成熟。当DCs成熟时，它们进入mLNs并与幼稚T细胞通信并进一步促进幼稚T细胞发育成CD4+T细胞，特别是CD4+调节性T细胞(Tregs)和T辅助性T细胞17(Th17)，两者都具有肠道趋向性。活化的T细胞在肠内稳态中起关键作用，如由Tregs诱导的粘膜耐受性和免疫抑制细胞因子的产生(例如IL-10)。值得注意的是，肠道共生菌和粘膜T细胞(例如Tregs)之间会发生相互作用，因为细菌代谢产物例如SCFAs促进这些细胞在肠道水平的维持。SCFAs的功能依赖于它们抑制组蛋白去丙酮酶活性的能力，表明存在表观遗传学相关的调节。或者，Tregs的发育是通过依赖多糖A和TLR信号到DC的途径介导。作为CD4+细胞的定义的子集的Th17细胞在肠固有层中很关键，它在预防病原体感染方面发挥着重要作用。由于Th17细胞分泌的细胞因子，包括IL-17，诱导IECs形成紧密的连接并分泌抗菌肽；Th17细胞也在黏膜免疫中起作用。IL-17还可进一步导致其它炎性细胞因子的释放。此外，中性粒细胞可以从血液循环中募集到肠道微环境中。在GF小鼠中，Th17细胞显著缺乏，但可由称为分段丝状细菌的特定细菌亚群（segmentedfilamentous bacteria）所诱导。 此外，系统性免疫应答可以通过微生物群介导的免疫细胞诱导来形成。当DCs呈递来自共生细菌的抗原到肠的mLNs以及B细胞和T细胞时，包括Tregs和Th17细胞，可在整个身体中行进，并通过与类似表位的交叉反应促进针对远处相同抗原的免疫应答或对抗其它抗原。显然，Th17细胞在功能上是具有可塑性的，因为它们可以基于局部炎性或非炎症条件改变它们的细胞因子的释放。 微生态平衡，称为生态平衡，对维持免疫具有重要意义。丰富多样的微生物群可以提高婴儿对各种疫苗的适应性免疫反应。特定的微生物组分通过激活TLR信号途径作为天然疫苗佐剂也可引发免疫应答。相反，生态失调会导致肠道菌群的平衡破坏。它具有以下特点：微生物群的多样性减少和相对不稳定，以及机会性病原体的潜在积累。当然，菌群失调会带来一系列的改变，例如，破坏粘膜屏障，并损害局部和全身免疫应答，肠道细菌转移至mLNs并进入外周循环。肠粘膜和mLNs中的细胞因子环境改变成倾向于炎症的表型，激活Th17细胞和效应T细胞，最终，局部和全身都会引起明显的炎症状态。 简言之，肠道菌群对局部和全身的免疫系统都产生了深刻的影响。此外，免疫系统也可以在不同的水平改变肠道菌群。 图1 肠道结构、微生物群和免疫 3 菌群与免疫治疗 如上所述，肠道菌群在免疫中起着不可替代的作用。同样，微生物在肿瘤免疫治疗中也起着重要的作用，尤其是ICIS。最初在小鼠模型中发现肠道菌群可以调节免疫检查点阻断的反应。目前，越来越多的证据表明肠道菌群可能在调节免疫治疗的反应中起着关键作用。其中，许多发现已在接受免疫治疗的患者中得到证实，如ICIs。 首先，免疫检查点抑制剂抗PD-1/PD-L1或抗CTLA-4的应答可能受肠道菌群成分的影响。对于PD-1/PD-L1的阻断，不同微生物对治疗的反应有显著性差异。肠道菌群分析表明，肿瘤生长缓慢的小鼠体内双歧杆菌种类明显增多，抗PD-1治疗有明显的改善作用。有较好微生物的小鼠，可通过FMT或同窝饲养转移到其他小鼠身上。此外，对肠道菌群不利的小鼠通过口服含有双歧杆菌的益生菌，从而提高了PD-L1阻断的抗肿瘤作用。这种作用主要来自于DC成熟的增强，从而提高了肿瘤特异性CD8+ T细胞的活性。经抗CTLA-4处理后，小鼠肠道菌群丰富度数量发生明显变化，主要表现为Bacteroidales和Burkholderiales的相对增加以及Clostridiales的减少。口服Bacteroidesfragilis菌剂同时使用用环磷酰胺(Taiotaomicron)或头孢菌素(Burkholderia Cepacian)可触发Th1反应，促进DC成熟，从而提高抗CTLA-4的疗效。而在使用广谱抗生素的GF小鼠和SPF小鼠中，抗CTLA-4的作用明显减弱，这种作用可通过FMT逆转患者的优势菌群。 此外，肠道菌群在免疫检查点阻断治疗的患者中发挥着重要作用，这是临床转化的基础。最近的研究证实了肠道菌群的重要性。在抗PD1/PD-L1治疗过程中，未使用抗生素治疗的上皮肿瘤患者的总生存率和无进展生存率明显高于接受抗生素治疗的肿瘤患者。这种现象表明，使用抗生素可能会破坏肠道菌群，从而损害抗肿瘤免疫和对免疫检查点阻断的反应。这些患者的粪便样本通过宏基因组测序显示，对PD1阻断有反应的患者的肠道细菌组成不同，存在丰富的Akkermansia和Alistipes菌。在抗PD1治疗前，通过在GF小鼠中使用来自应答患者(R)的粪便样本实施FMT，发现其免疫力增强，而接受FMt的GF小鼠的免疫可以单独使用Akkermansia muciniphila或联合使用E.hirae来恢复。有趣的是，A. muciniphilia与免疫细胞癌灶中的的浸润相关，随着CR9+CXCR3+CD4+T细胞被募集到癌灶中，CD4+T细胞与CD4+FoxP3+ T细胞Ttregs)的比率增加。在转移性黑色素瘤患者中，抗PD1治疗的疗效也受肠道菌群的影响。对PD-1治疗有反应的患者的肠道菌群的多样性显著增加，某些微生物比较丰富，如Clostridiales，Ruminococcaceae和Faecalibacterium。然而，对于无反应的患者，他们的肠道细菌多样性较低和具有更高的Bacteroidales菌丰度。对肠道菌群成分的分析和肿瘤微环境中的免疫谱分析表明，与肠道菌群不利的患者相比，具有良好肠道菌群的患者细胞毒性T细胞标记物和抗原处理和呈递的表达增强。另一项研究还表明，肠道菌群的差异发生在对ICIs的反应。特别是对PD-1阻断有反应的患者富含Bifidobacteriumlongum, Collinsella aerofaciens和 Enterococcus faecium。将应答者粪便样本转移到GF小鼠也成功地复制了优势表型：与接受无应答者粪便的小鼠相比，肿瘤生长较慢，治疗效果较好。上述结果是通过增加CD8+T细胞和减少肿瘤微环境中的Tregs来实现的。 对免疫检查点阻断剂反应差异的分析可能与几个不同的因素密切相关，例如分析样本的技术和所参考的数据库的差异。其他因素包括地理、饮食和生活方式，也可能是观察到的一些差异的原因。 然而，肠道菌群也会对免疫检查点阻断造成毒性。动物模型和临床队列研究了肠道菌群对毒性的影响。使用抗CTLA-4治疗的黑色素瘤患者中富含Bacteroidetes菌和各种遗传途径，涉及多胺转运和B维生素的合成，并未发生结肠炎。这种毒性可能与这些细菌的已知效应有关。其他研究还显示，在抗CTLA-4治疗后，在具有较高丰度的Faecalibacteriumprausnitzii菌和较低丰度的Bacteroides菌患者中存在较高的结肠炎风险。与反应和毒性有关的细菌具有不同的分类群，其中一些具有重叠的特征。根据相关研究，在ICIs中，参与反应和毒性的细菌分类群包含在硬壁菌门的Ruminococaceae科内。相反，缺乏对ICIs反应的细菌分类群包含在Bacteroidete门的Bacteroidales目中，但这些分类中的较高丰度通常会降低毒性的发生率。 总之，不可否认的是肠道菌群影响免疫治疗的治疗效果。肠道菌群既可以调节抗肿瘤免疫应答，又能调节对免疫检查点抑制剂的应答。 4 改善肿瘤治疗中的肠道菌群的挑战及对策 尽管肠道菌群有望用于肿瘤治疗，特别是免疫治疗，但仍有一些挑战需要解决。 首先，肠道内有害细菌的存在会对免疫治疗的效果产生负面影响。目前，抗生素可用于清除有害细菌，但也可能造成某些风险，包括由于缺乏特异性而导致的菌群失调。益生菌，包括饮食或化学物质，应该促进特定细菌的定植和相对扩张，这可能对抗肿瘤免疫产生有益的影响。在这方面，膳食纤维的成分可以被代谢产生具有免疫调节特性的短链脂肪酸，相关的研究已经证实了这一点。然而，益生菌的作用取决于宿主中已经存在的特定细菌。因此，益生素和特定细菌的结合，称为共生体，可能是有前景的。值得注意的是，在食品工业中，由于噬菌体对特定细菌的高选择性，噬菌体已被应用于消除有害细菌。 此外，尽管FMT在治疗难治性艰难梭菌腹泻方面取得了令人鼓舞的结果，但FMT需要考虑几个关键因素，特别是选择最佳的供体。理想情况下，FMT供体应该是具有多种微生物成分的个体，包括有利的细菌。到目前为止，Bifidobacteria spp. , Akkermansiamuciniphilia, E.hirae, and Bacteroides spp已被认为是“好细菌”，能有效地提高机体抗肿瘤免疫能力，更好地控制肿瘤在体内的生长。值得注意的是，病原体的转移也是一个潜在的问题，无论细菌、病毒或寄生虫等等都需要仔细检查。一些细菌似乎在炎症引起的癌变中起作用。将结直肠癌患者的肠道微生物群转移到GF小鼠体内，可引起不典型增生、息肉形成和肿瘤发生，这在正常供体移植过程中是不可能发生的。此外，从特定供体中转移共生细菌的一个理想选择是单独或联合使用特定的细菌。该策略将涉及三个方面： ①将提高宿主抗肿瘤免疫的准确的细菌进行分离， ②支持其体外扩增的培养条件， ③最后是保持生物活性的包装方法。 现有的测序方法可以优先检测最丰富的细菌，并有良好的临床效果，而忽略了较低数量的细菌。然而，这些细菌在功能上也很重要。因此，对珍稀微生物进行仔细的分离、培养和机制测试是值得考虑的。 此外，不同研究小组确定的细菌种类在癌症治疗中可能不一致。由N.Chaput等人研究发现B. fragilis在转移性黑色素瘤中所占比例较低，且Bacteroidales菌比例较高，阻碍了抗CTLA-4对转移性黑色素瘤患者的抗肿瘤作用。然而，Marie Véizou等人发现较高的B. fragilis比率有助于肿瘤消退。此外，N.Chaput等人研究观察到硬壁门菌，比如Faecalibacterium菌、产丁酸杆菌和G. formicilis与较高的应答率、更长的无进展存活率(PFS)和总存活率(OS)有关。此外，该小组注意到抗生素的使用并不影响主要微生物和细菌种类的组成，但可能影响疗效。这一现象与以前的研究不一致，因为抗生素的使用损害了ICIs的疗效，值得进一步研究。 有几个方面可以解释不同研究之间的差异： ① 偏好容易发生在FMT中，小鼠模型和人类模型之间存在差异限制了结论的外推。例如，通过移植肿瘤细胞在小鼠体内建立的肿瘤可能不能准确地反映人体对治疗的反应。 ② 与实际的肿瘤微环境相比，异种移植模型缺乏多步骤致癌和慢性炎症的过程； ③ 在小鼠体内注射肿瘤细胞通常伴随着肿瘤细胞的死亡，从而产生最初的免疫效果。 ④ 在小鼠实验中，由于qPCR分析某些细菌种类的局限性，很难排除其它细菌的干扰。 值得注意的是，除了治疗性结肠炎患者外，抗CTLA-4并没有引起肠道菌群成分的显著变化，这与Marie Vézou等人得出的结论相反。有趣的是，Mao K等人最近的一项研究注意到先天和适应性免疫反应影响肠道微生物群的状态。因此，可以想象释放的T细胞会重塑肠道菌群，例如某些细菌数量和比例的改变，甚至细菌形态和功能的变化。因此，今后应进行大量的研究以评估ICIs对肠道菌群的影响。 此外，应该强调的是不同研究之间存在差异。这些差异可能包括三个方面： ① 具有不同遗传和营养模式的患者， ② 在欧洲或美国不同地理位置进行的临床试验， ③ 以及黑色素瘤、肺癌和肾细胞癌等肿瘤类型。 鉴于这些方面，人们发现，通常与健康有关的细菌(例如，Ruminococcacae,Akkermansiamuciniphila,和 Bifidobacteria)或免疫原性(例如Enterococci,Collinsella和 Alistipes)可能在对肿瘤有反应的病人中富集。对541例血液病患者的研究表明，诊断时肠道菌群影响异基因造血干细胞移植(ASCT)后2年内复发的可能性。值得注意的是，主要由Eubacterium limosum组成大量的细菌群对预后有积极的影响。 其他因素也可以调节肠道菌群，包括饮食、睡眠周期、运动和药物等。因此，这些参数都可能与免疫检查点抑制剂和其它免疫治疗的疗效有关。 图2 改善肿瘤治疗中的肠道菌群的挑战及对策 a. 肠道中的不利细菌会对免疫治疗的效果产生负面影响。为了解决这一问题，抗生素可以用来清除有害细菌，但由于缺乏特异性，可能会带来诸如失调等危险。益生菌，包括饮食或化学物质，可以促进特定细菌的定植和相对扩繁，这可能对抗肿瘤免疫产生有益的影响。此外，益生素和特定细菌的结合，称为共生体，可能是有前景的。 b. 选择最佳的FMT供体是提高抗肿瘤免疫的关键。目前，一些细菌，包括Bifidobacteriaspp. , Akkermansia muciniphilia, E.hirae, and Bacteroides spp已被认为是一种“好细菌”，能有效地提高机体抗肿瘤免疫能力，更好地控制肿瘤在体内的生长。然而，病原体的转移是一个潜在的陷阱，需要清除致病菌。此外，现有的测序方法可能优先检测最丰富的细菌，具有良好的临床效果，而忽略了较低数量的细菌。因此，对珍稀微生物进行仔细的分离、培养和机制测试是值得考虑的。 c. 其他因素，包括饮食、睡眠周期、运动和药物，可以调节肠道微生物的组成，我们可以通过调控这些因素来增强抗肿瘤免疫力。 评论 微生态的时代已经悄然来临，关于微生物在癌症中作用的临床前和临床研究的开拓性报道使得肠道菌群成为一种很有前途的癌症治疗策略。我们已经观察到肠道菌群对肿瘤和免疫的影响，然而，其潜在的机制还不太清楚。此外，在如何调节肠道微生物群以提高肿瘤免疫治疗的效果方面，仍有一些挑战有待解决。目前尚不清楚肠道菌群的哪一种特殊成分最有利于促进抗肿瘤免疫的反应，并且有多种改菌群的治疗方法，这需要在临床试验中进行仔细的测试。只有充分理解这些相互作用，我们才能学会如何优化调节肠道菌群，以增强宿主的抗肿瘤免疫能力，并有可能改善免疫监视。
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