【原】科研 | Chemosphere：宏基因组学方法揭示了改良序批式低温反应器强化营养去除的微生物群落结构和机制

微生态 2021-04-13

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编译：傻狍子，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

为了在低温下有效去除生物营养素，本研究延长污泥停留时间（SRT），缩短好氧阶段，延长了缺氧阶段，在10°C下运行改良的序批式低温反应器（SBR）。结果表明:

① 氨（NH₄⁺-N），总氮（TN）和总磷（TP）的平均去除率分别为98.82％，94.12％和96.04％。碳源在典型的循环中的变化表明在微生物底物营养丰富期聚-β-羟基丁酸酯（PHB）（60mg/L）最大合成。

② 此外，在处理的120天后，污泥中的TP达到50.4 mg/g（78.4％为无机磷，21.6％为有机磷），表明该系统具有显著的P积累能力。氨氧化细菌（AOB）活性抑制试验证实，AOB和氨氧化古细菌（AOA）均参与氨氧化过程，后者占17％-19％。

③ 宏基因组分析表明了反应器的微生物组成，Candidatus Accumulibacter (12.18%), Dechloromonas(7.54%), Haliangium (6.69%) 和Candidatus Contendobacter (3.40%)。

④ 从反硝化基因角度来说，除亚硝酸盐还原外，反硝化聚磷的生物（DPAOs）在聚-β-羟基链烷酸酯（PHA）驱动的营养去除中起主导作用。

论文ID

原名：Intensified nutrients removal in a modified sequencing batch reactor at low temperature: Metagenomic approach reveals the microbial community structure and mechanisms

译名：宏基因组学方法揭示了改良序批式低温反应器强化营养去除的微生物群落结构和机制

期刊：Chemosphere

IF：5.34

发表时间：2019.11

通讯作者：周健

作者单位：重庆大学

实验设计

本文采用实验室规模的15L体积的SBR对污泥进行处理，每天采集沉积物，并收集测量NH₄⁺-N, NO₃^--N,NO₂^--N, PO₄^3--P、总磷和MLSS的浓度。然后对污泥样品进行冷冻干燥，对PHB进行测定。采用SMT分级法分析了磷形态在污泥中的分布，将潜在磷组分分为五部分，并采用钼蓝法测定中磷的含量。

在第181天时，将常用的AOB活性抑制剂烯丙基硫脲（ATU）加入SBR中，以确定氨氧化古菌（AOA）对氨氧化过程的单独贡献，并测定了加入ATU修正后的SBR中氮物种的变化。采用不加ATU的正常运行周期（第179天）的相应结果作为对比，估算了AOB和AOA的总贡献。

在180天时对污泥进行采样，并采用土壤DNA试剂盒从污泥中提取微生物DNA。之后使用自动聚焦声波基因组剪切仪将DNA破碎到300bp左右构建DNA文库。

对宏基因组数据进行测序，并使用SeqPrep、MetaGene等软件对测序结果进行处理。将获得的非冗余基因序列与NCBI NR数据库进行BLASTP比对，并对序列进行分类注释。同时通过与KEGG数据库比对进行功能注释，通过匹配的拷贝数对其丰度进行评价。最后通过检索NCBI NR数据库分类注释结果和比对基因结果，鉴定反硝化基因的宿主信息。

结果

1.在改良的SBR系统中对C、N、P进行去除

在10°C时，将SBR中SRT 60天改良为运行180天(图1)。可以发现，运行15天后，NH₄⁺-N浓度从16.3 mg / L逐渐降低到0.16 mg / L，最终保持一个稳定的状态，证明低温会抑制硝化速率，但是延长SRT可能是通过保留氨氧化微生物来补偿不良影响的有效方法，表明在此过程中实现了稳定的氨氧化过程。同时，处理后废水中硝酸盐浓度为1.90±0.91 mg / L，这可以认为是明显的反硝化效率的结果。此外，由于在原始接种物中PAOs活性较高，而废水中TP保持在较低的水平，这表明在该改进的系统中可以实现生物的除磷效果。在稳定阶段废水中NH₄⁺-N，TN和TP的浓度分别为0.44±0.17mg/L，2.62±0.94 mg/L，0.20±0.07 mg/L，平均去除率为98.82％，94.12％，96.04％。因此，我们成功构建了低温的条件下有效的生物学营养去除系统。

图1 在运行期间对A（N）和B（P）去除后的表现

图2描述了典型循环的系统表现。在厌氧阶段的最初30分钟内，COD浓度从306 mg/L急剧下降至28 mg/L，然后保持在较低水平。同时，PHB的合成达到最大值（60 mg / L），表明在此期间大部分溶解的碳源转化为细胞内碳源。在实验的三个有氧阶段，即60‒120分，360‒380分，580‒600分，氨氧化率分别为5.3 mg /（L·h），4.8 mg /（L·h）和4.7 mg /（L·h），这表明氨氧化率已达到稳定，这与之前的研究结果（5.1 mg /（L·h））相似。

反硝化过程主要发生在缺氧阶段的180-300分钟内，其特征是硝酸盐浓度从3.1 mg / L下降到0.1 mg / L。而且，与该阶段硝酸盐浓度的降低相对应，PO₄^3--P的浓度也出现了大幅下降（从4.3 mg / L降至0.8 mg / L），而PO₄^3--P / NO₃^--N为1.17，这与以前报道的用于脱氮除磷工艺的1.31和1.42接近。因此，我们推测在整个处理中成功的富集大量的DPAOs。由于延长SRT的硝化表现，可以缩短有氧阶段以减少需氧量的消耗源，而且通过延长无氧阶段以促进DPAOs的富集。因此，这种调节似乎是在低温下实现高级营养去除的可行方法。

图2 典型循环中A（DO，N，P）和B（COD，PHB，DRP）的变化

2. AOB活性抑制试验

AOB和AOA可以进行氨氧化，并且我们在该系统中同时发现了二者（见结果4）。为了阐明其在氨氧化过程中的作用，将广泛使用的AOB抑制剂（ATU）添加到系统中。根据以前的研究，当ATU浓度达到1‒10 µmol / L时，AOB的活性会受到抑制，而即使ATU浓度为100 µmol / L，AOA的活性仍不受影响。在当前的研究中，ATU抑制试验（ATU）浓度为20 µmol / L的条件下进行，结果如图3所示。在三个有氧阶段（60-120分，360-380分和580-600分）中，氨氧化速率分别为1.09 mg NH₄⁺-N/（g MLSS·h），0.97 mg NH₄⁺-N /（g MLSS·h）和0.97 mg NH₄⁺-N/（g MLSS·h）。每个好氧阶段的氨氧化速率分别降低了17％，19％和17％，这表明AOA在一定程度上参与了氨氧化过程。由于AOA的生长速率较低，延长SRT可能会增加AOA，且低温明显抑制了AOB的生长，而AOA可能具有耐冷的特性。因此，在温度为10°C时延长SRT 60天，有利于AOA与AOB竞争。

图3 在运行周期内添加ATU的加入N组分的变化

3. 通过SMT对污泥中磷组分进行分析

污泥中存储的P量可用来表示PAOs的P累积能力。在处理期间，MLSS系统维持在3890‒4150 mg / L之间，在处理120天后，污泥中的TP质量从22.5 mg / g MLSS逐渐增加到50.4 mg / g MLSS（图4）。因为该系统中污泥排放量有限，导致运行初期污泥中的P量相对较低，排放污泥中的磷质量小于废水中去除的磷，从而导致污泥中磷的积累。从运行第120天到第180天，排出的P量等于去除的P量，这表明污泥中的TP质量几乎保持恒定，这表明反应器已达到了稳态。

如图4所示，在整个运行期间，污泥中的OP质量约为11 mg / gMLSS，这与早期的结果相似。与OP相反，IP是污泥中的主要部分，主要分布在NAIP中（83.5％‒86.1％），NAIP是不稳定且可释放的P形式。谢等（2011年）研究表明生活污水处理的污泥中，NAIP占IP的80.9％以上，这与本研究基本一致。随着TP质量的增加，IP的比例从51.6％逐渐增加到78.2％，在第150天，IP质量达到最大值（39.8 mg / gMLSS），远高于其他报道（15.1-21.2 mg/ g MLSS）。许多研究发现IP，特别是NAIP，是EBPR污泥中的主要P组分。当考虑到P池中包括多聚P，大量的IP积累可能是由于SRT延长导致污泥中保留了大量的PAO和大量的可释放P。此外，PAO在低温下的碳开采优势也支持了显著的除磷表现。因此，本处理可以实现提高污泥每单位体积的P积累能力。

图4 在运行期间污泥中P浓度和P组分（%TP）的分布

4. 微生物结构和功能

注释的元基因组学序列总数约为3000万个读数，其中大多数分配给细菌，其次是真菌，古细菌，以及病毒。

在该系统中检测到77个门。如图5A所示，主要菌门包括变形杆菌门，拟杆菌门，放线菌门，疣微杆菌门，后壁菌门，蓝细菌和浮霉菌门等等。市政污水处理系统中广泛存在变形杆菌，拟杆菌，放线菌和疣状微生物。大多数厌氧铵氧化细菌都属于菌丝体。

图5B进一步展示了菌属水平的分类学信息。共鉴定到1,771属，其中没有分类学信息的占4.44％，远高于先前报道的742属。优势属依次为Candidatus Accumulibacter，Dechloromonas，Haliangium和Candidatus Contendobacter。Candidatus Accumulibacter，作为模式的PAOs属，广泛存在于生物除磷系统中，在该系统中表现较高的丰度。同时，根据针对DPAOs的研究，特定的念珠菌能够使用NOx-N作为电子受体实现缺氧磷的吸收。根据先前的报告，在传统的BNR系统中，念珠菌仅占1.37％，这表明延长SRT以及低温处理运行有利于有效富集念珠菌。同时，许多DPAOs属于脱氯单胞菌，具有细胞内碳合成和缺氧磷酸盐吸收的能力。因此我们推测，DPAOs在该系统中的养分去除起着关键作用。此外，具有糖原累积生物（GAOs）表型的生物被定义为弯曲念珠菌，在该系统中显示出高丰度（3.4％）。鉴于在念珠菌中检测到了编码反硝化相关酶的基因，推测该菌应该参与该系统中PHA驱动的反硝化作用。另外，例如延长SRT，缩短的好氧期、低温条件等特殊的操作条件下可能会出现念珠菌而不是竞争性念珠菌的富集现象。

研究结果表明，样品中占优势的氨氧化微生物是AOB和AOA，其中AOB包括亚硝基梭菌，亚硝基球菌，亚硝基梭菌和亚硝基螺菌，而AOA包括海洋氨氧化古菌和亚硝化螺菌属。即使AOA含量远低于AOB，但AOA在氨氧化过程中仍起着重要作用，这是因为AOB可以在寒冷的环境中生存和繁殖，在低温条件下AOB的抑制作用大于AOA。此外，亚硝酸盐氧化细菌主要由硝化孢菌，硝化细菌，硝基球菌和硝化螺菌组成。有趣的是，在该系统中我们还发现了厌氧细菌念珠菌。

图5（A）主要门水平（相对丰度> 0.2％）和（B）前20个属水平上相对丰度

5.反硝化基因和微生物贡献分析

本实验中预期用DPR工艺来实现营养去除。因此，有必要对反硝化作用途径进行分析。本实验通过KEGG数据库注释负责反硝化代谢途径的功能基因，并通过衍生来自某个特定分类群（酶）的编码基因的比例来量化微生物对每种反硝化功能酶的贡献。

如表1所示，硝酸盐还原酶和周质硝酸盐还原酶的编码基因都参与反硝化作用的第一步。结果表明，PAO或DPAOs（称为假丝酵母和脱氯葡萄球菌）是参与此步骤的主要基因宿主微生物（总共携带了这些基因的30.7％）（图6A）。嗜热单胞菌（一种著名的异养反硝化微生物）和白色念珠菌（GAOs），分别占引起硝酸盐还原基因的9.9％和9％。部分研究人员认为，念珠菌缺乏硝酸盐还原能力，磷的吸收取决于其它微生物产生的亚硝酸盐，其他报告也给出相同的结论。在这项研究中，念珠菌携带靶向硝酸还原酶的编码基因这一事实已被宏基因组学分析所证实。此外，DPAOs在硝酸盐还原方面也发挥了重要的作用。这些矛盾的结果可能归因于进化枝相关的差异。为了深入了解硝酸盐还原酶类别，我们通过网络分析揭示了narG和napA的微生物起源（图6B）。有趣的是，DPAOs保留了napA的65.8％，而narG仅占4.8％。narG的主要来源是假丝酵母念珠菌（CandidatusContendobacter）和嗜热丝菌（Thermonas），它们均携带此基因。因此，在该系统中，我们可以从该结果推断出，通过DPR途径进行的硝酸盐还原主要是由周质硝酸还原酶催化的，而传统的以及PHA介导的反硝化主要与硝酸还原酶有关。

在亚硝酸盐还原过程我们仅检测到nirK，其中41.7％主要由铁矿沙单孢菌属提供，而16.6％来自固氮弧菌属。这些属在之前的研究中报道可以携带nirS基因型的反硝化剂，添加亚硝酸盐后可显着富集。除本研究外，对nirK型球菌和偶氮菌鲜有报道。当前研究表明，nirS型反硝化器更有可能执行短程反硝化的所有三个步骤，由于共有的调控机制依赖于nirS,nor和 nos 基因的存在。同时，在nirK型反硝化器中未观察到这种共享的调节机制。因此，可以推断增强细胞内碳的合成会导致有机碳的溶解度降低，从而限制了整个反硝化作用。因此我们得出结论nirK型反硝化器倾向于主导以PHA强化利用为特征的系统，换句话说，传统的反硝化器在该系统的起反硝化作用不是很完全。

鉴于部分反硝化细菌没有nosZ基因，反硝化的最终产物是一氧化二氮（N₂O），这会对臭氧层消耗和全球变暖产生巨大影响。从nosZ基因的角度来看，大多数N₂O还原酶并不是传统的反硝化微生物和PHA依赖的反硝化微生物，均由该基因编码。在已知的属中，尤其是念珠菌和脱氯单胞菌是N₂O的主要清除剂，它们分别携带该基因的20.1％和11.5％。该结果表明，PHA驱动的氮和磷反硝化去除可以明显消除N₂O的排放。另外，我们发现nirK基因的最主要宿主微生物缺乏nosZ基因，将其称为Arenonimons和Azoarcus，这与N₂O是在短程反硝化过程中积累的观点相一致。

之前的研究结果表明，反硝化的所有四个步骤都可以通过部分反硝化细菌独立完成。然而，在本研究中没有发现微生物具有完整的反硝化相关功能基因，这表明该系统中反硝化是由不同的微生物协同作用的。总而言之，DPAOs确实负责消耗PHA的同时去除氮和磷。考虑该技术能实现全部能量利用和较少的废物产生（主要是过量污泥的排放），该技术被证明是低温去除营养物的理想方法。

图6 主要宿主及其对编码反硝化相关酶的基因的贡献（A），以及对代表性硝酸盐还原酶编码基因（narG和napA）与它们的分类起源之间的相关性进行网络分析（B）。菱形节点代表基因类型（narG和napA），而圆形节点代表关键属。连接是指这个属是该基因的潜在宿主 (仅展示narG/napA起源的1%以上的属)。