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编译：大玉儿，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 噬菌体已被提出作为农药的替代品来杀灭农作物的致病菌。然而，噬菌体的生物防治效果是可变的并在自然根际微生物中了解甚少。研究人员研究了不同噬菌体组合对番茄青枯菌（Ralstonia solanacearum）感染的生物防治效果。在单一作物季节的温室和田间试验中，增加噬菌体组合的数量可使发病率降低80%。发病减少的原因是病原体密度降低，选择了耐噬菌体但生长缓慢的病原体株，并富集了对青枯菌有拮抗作用的细菌种类。噬菌体处理不影响现有的根际微生物。特异性噬菌体组合可能成为控制植物致病菌的精密工具。 论文ID 原名：Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato 译名：噬菌体组合防控番茄土传青枯病 期刊：Nature Biotechnology IF：31.864 发表时间：2019.12 通讯作者：韦中，沈其荣，Ville Petri Friman 作者单位：南京农业大学和英国约克大学 实验设计 1 菌种和噬菌体组合 用青枯病（R. solanacearum）菌株QL-Rs1115作为本实验的模式植物致病菌。该菌株在所有实验前常规培养于30℃的NB培养基中（葡萄糖10.0gl-1，蛋白胨5.0gl-1，酵母提取物0.5gl-1，牛肉提取物3.0gl-1）摇晃24小时（170转/分）。研究人员将从中国四个地理距离较远的番茄地中分离得到的4种裂解性噬菌体（NJ-P3、NB-P21、NC-P34和NN-P42）作为模式噬菌体。最初的噬菌体库通过每个噬菌体单独与储存的青枯病菌株在NB培养基上培养24小时，之后离心和过滤从细菌中分离和纯化噬菌体。调整噬菌体滴度至每毫升107个噬菌体颗粒，噬菌体库于4℃保存。在所有可能的组合中，噬菌体分别以100%、50%和33%的噬菌体单株培养，组装成1种、2种和3种噬菌体类型的群落并保存在4℃。所有噬菌体的序列进行了详细分子表征，利用Illumina Hiseq 4000平台进行全基因组测序，使用GeneMarkS进行基因预测和注释。此外，使用从最初分离噬菌体的四个田间中分离出的96株青枯病菌株定量了噬菌体的感染性范围。 2 温室和田间试验中评估噬菌体组合的有效性及温室实验结束时土壤样本采集 用番茄进行了45天的温室试验，以测试在天然根际微生物组存在下噬菌体组合的生物控制效果。温室试验于2017年8月至10月进行。番茄种子首先表面灭菌并在水琼脂上发芽2天，然后把种子播种到装有200g苗床基质的播种盘里。在三叶期，番茄植株被移栽到八格的育秧盘上，每个格子都含有600g从中国江苏省宜兴市（119°44′E, 31°22′N）收集来的均质、非无菌的水稻土。这个天然的土壤含有丰富的细菌，但不含青枯病致病菌或它的噬菌体。移栽7d后，用移液管接种青枯病QL-Rs1115致病菌悬液到植物根部，每克土壤约107个细胞。在接种病原菌两天之后，用不同的噬菌体组合接种植株。在接种病原菌两天之后，用不同的噬菌体组合接种植株，每个噬菌体处理的最终浓度为每克土壤中约106个噬菌体颗粒。对照处理仅包括病原体，不添加噬菌体。每个噬菌体组合处理重复三次，每个重复育秧盘包含8株番茄植株（每个噬菌体组合共有24株，包括对照处理在内共360株）。在试验结束时（接种病原菌后38天），记录病害发生情况，并从每个重复育秧盘中（对于少于两株健康植物（8.89%）的处理，用轻度病变的植物代替）随机选取两株健康植株，收集根际土壤样品，共收集根际土壤样品45份。每1克根际土样品直接用于分离噬菌体群体，与9mL水混合，氯化、过滤并保存在4℃下。另2g样品置于15%甘油中- 80℃保存，用于测定青枯病种群密度、DNA提取用于测定细菌群落组成和分离病原体菌落用于后续的适应度测定（噬菌体抗性和抗性成本）。 温室试验结果经南京麒麟大田（118° 57′ E, 32° 03′ N）试验验证，在那里测试了相对于对照处理（无噬菌体）的单噬菌体和四种噬菌体组合的生物控制效率。试验于2017年8月至9月在番茄栽培15年的田间进行。实验过程中未使用任何农药，并使用了标准的化学施肥。该大田已自然感染青枯病10余年，2016年出现高枯萎病（秋季约80%，春季约40%），这使任何脆弱作物的种植难以进行，如西红柿或土豆。番茄幼苗在苗圃托盘中生长30天后移栽到大田（270–300 m2）。在移栽后第7天，用移液管将噬菌体（每个植株约109p.f.u）涂于番茄植株的根部。除了四个独立的噬菌体和四个噬菌体组合处理，还建立了不使用噬菌体的对照处理（普通的M9缓冲液）。每个处理中包含48株番茄植株，这些番茄植株是从20 m2实验面积（总的大约有1000株移栽苗）中所有移栽植株中随机选择的。接种后45天记录青枯病严重程度，采用0~4分制，作为各植物病害指数的平均值（0，没有枯萎的迹象；1，1-25%的叶面积枯萎；2，26-50%的叶面积枯萎；3，51-75%的叶面积枯萎；5，76-100%的叶面积枯萎）。 3 温室实验结束时青枯菌和噬菌体密度定量分析 用定量PCR方法测定了青枯病密度。提取的DNA通过fliC基因（编码R. solanacearum鞭毛亚基）对青枯菌密度进行定量。在软的双琼脂覆盖层上用斑点法测定噬菌体密度。简单的说，纯化后的噬菌体和均匀覆盖的青枯病菌株在琼脂平板上进行稀释和斑点培养。30℃培养24小时后，通过p.f.u计数来计算噬菌体密度。 4 定量分析噬菌体的抗性和进化的青枯病分离菌产生抗性的成本 为了确定温室试验期间的噬菌体抗性演变，从半选择性琼脂培养基（M-SMSA）上连续稀释的低温保存的根际亚样本中分离出青枯病细菌。30℃生长48小时后，每个噬菌体组合处理重复中随机分离出8个克隆出来，并置于96孔微孔板上在NB培养基中30°C单独培养24小时，然后置于15%甘油中-80°C低温保存。在温室试验中，分别测定了病原菌对其接触过的每个祖先噬菌体的抗性。然后将噬菌体抗性计算为对所有这些噬菌体的平均抗性。在温室试验结束时，测定了来自同一重复种群的共进化噬菌体种群对现代噬菌体的抗性。因此，这些抗性测定包括两个和三个噬菌体组合处理中的多个噬菌体，而不进一步了解它们各自的频率。在这两种情况下，噬菌体抗性被确定为病原体在液体培养基中的生长降低。简单地说，在30°C的96孔微孔板上，用分光光度计在24小时的时间点上（optical density，OD600），分别在每个祖先噬菌体和当代噬菌体的存在和不存在的情况下（接种量为每毫升约106个噬菌体），测定了祖先和进化的青枯病菌落（每毫升107个细胞的接种液）生长情况。相同的细菌菌落也被用来量化在没有噬菌体的存在下的细菌生长的抗性成本，使用模型根分泌物培养基由OS基本培养基补充10 mM浓度48个不同的包括糖类、氨基酸和有机酸一般在番茄根部分泌物中发现到的碳资源组成。抗性的成本被确定为在4小时间隔（OD600）的24小时内细菌最大密度相对于祖先菌株的降低。 5 进化后的耐噬菌体的青枯病菌株与敏感的祖先病原体菌株的竞争能力比较 用红色荧光标记的祖先青枯病菌株直接共培养竞争法测定了已进化的耐噬菌体病原体菌株的竞争能力。为此，使用红色荧光信号测量了祖先QL-Rs1115-RFP（接种量为每毫升约106个细胞）菌株在存在或不存在每个单独进化的病原菌分离菌（n= 361）的96孔微孔板上30°C，24小时的生长。进化后的病原菌菌株的竞争能力，用下面的公式来衡量祖先QL-Rs1115-RFP菌株在没有（OD600a）和存在（OD600p）进化菌株的情况下的生长差异：Competitive ability= （OD600a− OD600p）/OD600a× 100。 6 测定根际微生物群落组成的变化 使用Illumina公司MiSeq测序测定了噬菌体组合对根际细菌微生物组组成的影响。利用引物563F（5′-AYTGGGYDTAAAGVG-3′）和802R（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）对16S rRNA基因的V4区进行扩增。 7 用培养和非培养的方法测试三噬菌体组合对细菌群落组成和多样性的直接影响 使用非培养方法直接检测在没有病原体的情况下，三种噬菌体组合的存在是否直接影响了天然根际微生物群落的组成和多样性。简而言之，根际微生物接种液通过水稻土-无菌水混合物（1:9）来制备的。然后我们接种8μl这个接种液（每毫升约108个细胞）到每孔包含792μl的25% NB培养基的48孔微型板，这些孔之前单独或一起接种青枯病和三噬菌体组合（最终浓度在病原体细胞约106菌落和噬菌体约105p.f.u）。以根际微生物组单独接种作为对照。在30℃摇晃（170转/分）培养48小时后，提取DNA对16S rRNA基因MiSeq测序用来测定细菌多样性和丰度。然后，通过依赖培养的方法测试了非致病性细菌分离株对感染了青枯病的噬菌体的敏感性。为了实现这一目标，使用非选择性琼脂培养基从相同的水稻土中随机分离出可培养的细菌。将系列稀释后的土壤悬浮液分散于琼脂培养基上在30℃培养48小时。使用相同土壤库的4个重复土壤样本，每个复制随机抽取100个菌落，共分离出400个菌落，用引物对27F和1492R对整个16S rRNA测序基因对这些菌落进行鉴定。不致病的病毒的易感性噬菌体测试使用连续测定通过测试时如果细菌生长抑制有“线”干的噬菌体NB琼脂板上（40μl）。如果噬菌体对生长没有明显的抑制作用，与对照处理（平板上没有噬菌体的条状细菌）相比，菌株被认为是耐药的。 8 非致病菌分离株对青枯病病原菌抑菌作用的测定 结果 1 噬菌体对温室和田间病害发生的影响 研究人员利用从中国番茄田分离到的噬菌体组成1-4种噬菌体组合，这些噬菌体尽管遗传相似度高（相似度>99%），但侵染范围明显。增加组合中的噬菌体数量有望通过提高感染效率和降低噬菌体耐药性的进化率来加强对病原体密度的控制，这是由于广泛的噬菌体耐药性的进化需要更高数量的突变。尽管与温室试验对照相比，单一类型的噬菌体降低了青枯病的发病率（F1,14= 6.842，P= 0.021，图1a），但是含有较多噬菌体的噬菌体组合能更有效地降低疾病的发病率（R2= 0.315，P= 6.518× 10−5，图1a）。发病率的降低可以用病原体密度的降低来解释，这种效应随着噬菌体数量的增加而增强（R2= 0.186，P= 0.003，图1b）。增加噬菌体的数量也会对噬菌体的总密度产生负面影响（R2= 0.178，P= 0.003，图1b），这证实了噬菌体密度取决于宿主的丰度，这是由噬菌体和病原体密度之间的正相关关系所表明的。除NB-P21噬菌体对病原体密度影响不显著外，所有噬菌体类型对疾病发生率和病原体密度均有明显的负作用。 在田间实验中，研究人员观察到了类似的结果。在田间试验中，四种噬菌体均有较好的生物防治效果（F3,191= 0.385，P= 0.764，图1c）与对照处理相比，青枯病严重程度（疾病指数）平均降低80%（F1,287= 89.315，P< 0.001，图1c）。然而，尽管在处理间观察到相当大的差异，但四噬菌体组合在所有的处理中导致最低的平均疾病指数具有最高的生物防治效果（F2,287= 47.057，P< 0.001，图1c）。这些结果表明，虽然所有噬菌体类型都能有效降低青枯病的发病率，但它们在温室和田间条件下组合使用时更有效。 2 温室试验中噬菌体抗性的进化 接下来，研究人员在温室实验结束时研究了噬菌体抗性的进化及其相关成本。为病原体选择已增加了对祖先噬菌体的抗性（F1,44= 14.198，P< 0.001，图2a）的所有噬菌体类型，一般来说，在温室试验中，当病原体暴露于噬菌体组合中时，它们会产生更广泛的耐药性（R2= 0.287，P< 0.001，图2a）。研究人员还发现，当病原体在有噬菌体组合存在的情况下进化时，它们对祖先噬菌体和共同进化的噬菌体通常保持更高水平的抗性（F2,41= 0.054，P= 0.947，图2b）。这些结果表明，在三噬菌体组合的作用下，病原菌对噬菌体的抗性范围最广。 进化对噬菌体的抗性代价高昂，因为在没有噬菌体的情况下，病原体的生长速度会降低（承载能力，F1,44= 14.684，P< 0.001，图2c；最大增长率，F1,44= 6.293，P= 0.016，补充图6）。此外，当病原体暴露于多种噬菌体中时，噬菌体抗性与生长之间的负相关性更大（承载能力，R2= 0.308，P= 2.2× 10−16，图2d右上角的小插图）。在与噬菌体敏感的祖先病原体基因型的竞争实验中，这种生长成本也与耐药病原体竞争力下降有关（F4,47= 7.303，P< 0.001；补充图7）。综上所述，这些结果表明噬菌体组合可以选择耐药但生长缓慢的病原体，从而降低疾病的发病率。 3 噬菌体对根际微生物群的影响 在温室试验结束时，噬菌体的存在对根际微生物群落的组成有很大的影响（F1,43= 2.101，P= 0.001，图3a）。具体来说，噬菌体组合中噬菌体数量的增加与细菌群落多样性的增加有关（香农多样性指数，R2= 0.449，P= 7.428× 10−7，图3b；OTU丰度，R2=0.308，P= 8.138× 10−5，补充图8），并且绿弯菌门（R2= 0.509，P= 6.814× 10−8）、酸杆菌门（R2= 0.214，P= 0.001）、浮霉菌门（R2=0.157，P= 0.005）和厚壁菌门（R2= 0.157，P= 0.005）的相对丰度高，变形菌门（R2= 0.140，P= 0.008）和拟杆菌门（R2= 0.184，P= 0.003）的相对丰度低（图3c和补充图9）。为了更详细地分析这些模式，构建了基于OTUs的单噬菌体和三噬菌体群落的共现网络，并使用Netshift分析来识别群落变化背后潜在的重要驱动分类群。初步筛选后，在两个网络中（补充图10）都保留了500个类群（节点）。平均而言，单噬菌体网络连接更紧密，路径长度更短，这表明它们之间的相互作用可能更频繁（补充图10和补充表4）。在这两个群落311分类群中，只发现9个。而在单噬菌体和三噬菌体群落中，大部分类群的结合体是完全不同的，且显著的结合体数量随着噬菌体数量的增加而增加（图3d；分别有72和230结合体）。此外，Netshift分析发现40个潜在的驱动分类群与微生物组组成的变化有关（图3d）。在三噬菌体中，相对于单噬菌体群落，有16个类群的数量增加，7个类群的数量减少，并且Pseudobacteroides，Gaiellales，Luteimonas和另外两个放线菌（288-2_norank和Elev-16S-1332_norank）被发现在改变网络结构中起到关键作用（图3d和补充表5）。 为了验证这些变化不是由噬菌体直接驱动的，研究人员使用了一个短期的实验室实验来测试病原体和三噬菌体组合如何影响根际群落的组成和多样性，其中土壤洗剂中的土壤与温室实验使用的土壤相同。研究人员发现，在没有病原体的情况下，噬菌体的存在并不影响微生物群落的组成或多样性（组成，F1,14= 1.165，P= 0.300，图4a，香农多样性指数，F1,14= 1.502，P= 0.242，图4b），而病原体的单独存在有很大的影响（组成，F1,5= 239.545，P< 0.001，图4a；香农多样性指数，F1,5= 243.884，P< 0.001，图4b）。噬菌体的存在限制甚至阻止了病原体介导的群落组成和多样性的变化（图4a，b）。为了更详细地研究这个问题，研究人员随机分离来自同一根际土壤的400株可培养菌株，分别测试了它们对感染青枯病的噬菌体的敏感性（图4c，补充表6）。发现这四种噬菌体都不能感染这400个分离株中的任何一个（补充图11）。这些结果表明，噬菌体只能侵染病原体，根际微生物群落组成、多样性和物种共生网络的变化是由间接反馈驱动的。 接下来，研究了在噬菌体存在的情况下细菌类群在属水平上的功能特性。细菌属丰度与群落中噬菌体数量呈正相关（22.30%正显著相关，6.68%负显著相关，补充图12a），大多数显著受影响的属属于变形杆菌门、放线菌门，厚壁菌门和绿弯菌门（补充图12b）。为了确定丰富的细菌类群如何与病原体相互作用，研究人员在实验室中进行了成对竞争共培养实验，使用的是祖先病原体和所有400个分离的非致病性根际细菌（图4c）。研究人员发现富集菌属于Acinetobacter（n= 12），Bacillus（n= 67），Comamonas（n= 7），Ensifer（n= 10）和Rhodococcus（n= 4），这些属多为拮抗病原菌，平均减少病原菌生长64.89%（图4d）。在温室试验中，这些细菌可能通过资源或干扰竞争的方式对青枯菌产生抑制作用。 4 噬菌体生物防治的生态学和进化特征 通过偏最小二乘结构方程模型分析（PLS-SEM）和路径模型估计（pathway-modeling estimation）分析了温室中噬菌体生物防治成功背后的生态和进化机制的相对重要性。具体来说，研究人员探索了噬菌体组合的有益影响是如何通过降低病原体密度和噬菌体抗性生长权衡来调节的。最终的完整模型能够合理地解释36%的发病率变化（χ2= 31.7和NFI= 0.81）并且随着组合中噬菌体数量的增加，对噬菌体的抗性增强，病原菌的生长速度减慢（承载能力，图5）。病原携带能力的降低与病原丰度的降低呈正相关，而病原丰度的降低又与疾病的发生呈正相关（图5）。这表明，噬菌体介导的选择高度耐药但生长缓慢的病原体，对降低病原体的丰度和降低疾病的发病率有重要作用。病原菌丰度与微生物群落多样性呈负相关，而噬菌体抗性进化与微生物群落多样性呈正相关（图5）。通过构建更简单的结构方程模型进一步验证了这些结果（补充图13）结果表明：噬菌体数量的增加通过携带能力对病原菌密度有负向影响（λ= 0.514，P= 0.001，补充图13a），微生物多样性（香农指数）与病原菌密度呈负相关（λ=−0.467，P= 0.015，补充图13b和补充表7）与微生物群落多样性相比，病原密度的变化对发病率的影响更大（λ= 0.460，P= 0.010，补充图13c和补充表8）。这些结果表明，生态学和进化机制在解释发病率下降方面都是重要的。 讨论 本研究证明了噬菌体可以作为一种精确的工具来改善温室和田间的植物健康。值得注意的是，噬菌体生物防治的效果是由生态机制（噬菌体杀死病原体）和进化机制介导的，因为疾病的减少与选择高度耐药但生长缓慢的病原体有关。此外，噬菌体对病原菌的作用也间接改变了常驻菌群的组成和多样性，增加了对病原菌高度拮抗的细菌类群。该研究结果强调了在设计用于农业和生物技术的噬菌体疗法时，考虑微生物群的生态和进化机制的重要性。 在温室和田间试验中，增加噬菌体的数量可以提高噬菌体组合的生物防治效果，包括更大幅度地降低病原菌密度、病害发生率和病害指数。虽然噬菌体组合选择对祖先和共同进化的噬菌体的抗性是昂贵的，但是导致了病原体的生长和竞争能力的降低。这些结果与先前的研究结果一致，即噬菌体组合在控制致病性细菌的密度和交叉耐药突变导致的耐药范围的进化方面的有效性增强。虽然噬菌体组合由基因高度相似的噬菌体组成（>99%相似），但它们具有明显的感染性和对噬菌体耐药性进化的影响。虽然无法发现噬菌体感染的确切机制，但研究人员推测，噬菌体使用不同的受体或机制来杀死病原体，因为之前接触不同的噬菌体组合需要进化出对所有祖先噬菌体的高水平的耐药性。他们还发现，当病原体同时暴露于多种噬菌体中时，它们能够进化出对祖先噬菌体和共同进化噬菌体的抗性。这一结果表明，噬菌体多样性可能影响共同进化动力类型和多面手（军备竞赛动力学）或专家（波动选择动力学）噬菌体抵抗策略的选择。在未来，研究噬菌体的选择是否能够在更长的时间尺度上限制青枯病的爆发，从而使病原菌重新进化并恢复它们的竞争能力，这对于研究在连续的植物世代中这些影响是很重要的。 噬菌体抗性的进化是代价高昂的，因为它降低了病原体的最高生长速度、携带能力和对非抗性祖先菌株的竞争能力。在不同的噬菌体系统中，包括青枯病及其噬菌体，经常可以观察到这种成本。研究人员发现成本的大小随着噬菌体抗性范围的增加而增加。一种可能的机制是，不同噬菌体的选择可能会损害几种噬菌体受体，导致耐药性成本上升。例如，噬菌体通常与跨膜蛋白结合，而跨膜蛋白也被用来吸收营养物质，虽然这些受体的突变可以使细菌对噬菌体产生抗药性，但它们往往会降低细菌的竞争适应性。这种代价在复杂的土壤微生物群落中尤其严重，因为那里的资源往往有限，病原体需要与无数的其他细菌竞争。除了降低了病原菌的竞争能力外，生长速度的降低还可能降低了病原菌侵染植物的能力，这是由于群体感应触发了青枯病毒力基因的表达，这就需要较高的病原菌种群密度。由于调控网络和关键调控基因的重叠，青枯病的代谢变化也可能与其毒力有关。结构方程建模结果间接支持了这一观点，它表明噬菌体对病原体密度和发病率的影响是通过抗性介导的降低病原体的携带能力来实现的。识别驱动关键代谢和毒力调节“中枢”进化变化的噬菌体可能对治疗目的特别有益。此外，研究结果表明，噬菌体与细菌的相互作用改变了病原菌与植物相互作用的生态学，从而降低了疾病的发病率。这种生态进化反馈在之前的许多系统中都有发现，本研究结果表明，它们可能对农业环境中的植物病害动力学也很重要。 在组合中增加噬菌体数量与本地细菌根际微生物群落的组成和多样性的变化密切相关。这种影响是间接的，因为没有一种噬菌体能够感染任何自然分离物，而三种噬菌体组合对根际微生物群落的组成或多样性没有显著影响。虽然本研究收集的分离菌可能不能完全代表整个根际土壤的多样性或目前的情况，但更有可能的是，噬菌体介导的效应是通过降低病原体密度和降低病原体竞争力的选择来间接驱动的。表明噬菌体是一种安全、环保的植物致病菌控制生物资源。根际微生物群落多样性与植物健康之间的相似的正相关关系，此前已经在被青枯病毒害的农田中观察到，这种差异被认为是健康植物和患病植物根系分泌物模式不同的结果。值得注意的是，研究人员发现一些细菌类群的丰度与噬菌体组合中噬菌体的数量呈正相关，它们通过资源或干扰竞争对病原体表现出高度的拮抗作用。此外，他们还发现了几个在细菌共现网络中起关键作用的候选驱动分类群，并且与单噬菌体细菌群落相比，它们在三噬菌体中富集。例如，芽孢杆菌属，此前已被证明对耐噬菌体的青枯病菌株具有很高的抗生素活性，随着噬菌体组合中噬菌体数量的增加而大量增加，其中大多数对病原体具有拮抗作用。因此，存在于菌群中的拮抗细菌的富集进一步加强了噬菌体的作用。在未来，利用宏基因组测序来研究植物发育过程中的这些模式将是很有趣的，重点是更广泛的微生物群落多样性，包括真菌和原生生物。
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