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编译：Mina，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读乳腺炎是全世界奶牛场中最流行的疾病之一。肠道菌群在调节系统性和局部炎性疾病（如乳腺炎）中起着重要作用。然而，肠道菌群对乳腺炎的调节机制仍不清楚。因此，本研究的目的是研究肠道菌群在宿主抵抗金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）感染引起的乳腺炎的防御中的功能和调控机制。与对照小鼠相比，观察到肠道微生物群失调症小鼠血-牛奶屏障通透性，以及金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎严重性增加。此外，已建立的对共生稳态的破坏导致致病性肠杆菌细菌的丰度大大增加，而产生短链脂肪酸（SCFA）的细菌门（Firmicutes和Bacteroidetes）的相对丰度却大大降低。但是，对肠道菌群失调症小鼠进行小鼠粪便微生物菌群移植（FMT）可以逆转这些变化。此外，丙酸钠，丁酸钠和益生菌（产生丁酸盐的细菌）的施用可以逆转血-奶屏障的变化，并降低金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的严重程度。总之，这一新发现表明，肠道菌群可作为宿主防御乳腺炎的保护因子，靶向肠道-乳腺轴的乳腺炎是一种有希望的乳腺炎治疗方法。 原名：The gut microbiota contributes to the development of Staphylococcus aureus-induced mastitis in mice 译名：肠道微生物群在金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎中的贡献 期刊：ISME IF：9.493 发表时间：2020.04 通讯作者：付云贺&张乃生 本实验以8-12周的BALB/c小鼠（336雌性和168雄性）为实验对象，用广谱抗生素进行喂养，然后再让小鼠感染金黄色葡萄球菌S.aureus SA113 (ATCC35556)。为了保护SCFAs，在金黄色葡萄球菌感染前1小时向腹腔内注射丁酸钠，丙酸钠或醋酸钠。为了保护乳腺中酪丁酸梭菌(C. tyrobutyricum)，在感染前连续口服灌胃酪丁酸梭菌7天（每天一次）。1 肠道菌群对金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎的保护作用 图1结果表明肠道菌群失调小鼠的乳腺组织形态改变，中性粒细胞的渗透增加；中性粒细胞，巨噬细胞，T细胞，NK细胞数量增加，CD4+/CD8+细胞比例降低；TNF-α，IL-1β，IL-6（图1b–d）和MPO水平升高（图1e）；血-奶屏障通透性增加（乳腺中Occludin，Claudin-3和ZO-1的水平降低（图1f））; 与未经处理的小鼠相比，肠道屏障被破坏（肠组织中Occludin，Claudin-3和ZO-1的水平降低）。FMT可以改变这些变化（如图1a-f所示）。此外，被金黄色葡萄球菌浓度梯度感染后，肠道微生物感染小鼠表现出更严重的病理变化（图1a）；中性粒细胞，巨噬细胞，T细胞和NK细胞的数量增加，CD4 + / CD8 +细胞的比例降低（参见补充图S2）；TNF-α，IL-1β和IL-6水平升高（图1b d）；与未感染金黄色葡萄球菌的小鼠相比，MPO活性升高（图1e）。但是，在接受FMT后的小鼠在感染金黄色葡萄球菌的浓度梯度后，这些变化得到了明显缓解（图1a-e）。最后，我们研究了提高血乳屏障通透性是否有助于阻止细菌离开乳腺组织并进入体循环。结果表明，与未经治疗的小鼠血液相比，肠道金黄色葡萄球菌感染小鼠在金黄色葡萄球菌暴露后24小时血液中的细菌负荷增加。但是，与肠道微生物菌群失调症小鼠相比，FMT对肠道微生物菌群失调症小鼠的细菌载量较低。
图1 肠道菌群对金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎的保护作用。感染金黄色葡萄球菌（1105、1106和1107 CFU）后24小时，从未经治疗的小鼠，肠道菌群失调症小鼠和FMT到肠道菌群失调症小鼠收集乳腺组织。用H＆E（100）染色乳腺组织切片。
2 Abx（抗生素混合物）治疗和FMT后小鼠肠道菌群的特征 为了评估肠道细菌群落的物种丰富度和多样性，本文分析了观察到的物种以及每个样品的香农多样性指数。结果表明，Abx组的肠道菌群的细菌富集度和多样性显着低于其他任何组。此外，对Bray-Curtis异同性进行的非度量多维标度（NMDS）排序显示，Abx处理的小鼠粪便的细菌群落特征与未处理组的样本细菌群落特征不同，而FMT组的细菌群落则接近于未治疗组。这些结果表明，Abx处理可导致肠道菌群失调，而FMT可逆转Abx诱导的细菌群落结构。此外，细菌菌群的检测表明，与未处理小鼠粪便菌群相比，Abx处理小鼠粪便菌群中变形杆菌的相对丰度显着增加，而厚壁菌和拟杆菌的相对丰度显着降低（图2a，b）。在属水平上，粪便微生物群中的四个优势细菌属表明，肠杆菌的相对丰度显着增加，而乳酸杆菌和拟杆菌的相对丰度降低了，普雷沃氏菌科UCG-003的丰度与Abx治疗组相比没有显着差异。对照组。但是，FMT明显逆转了这种效应（图2c，d）。 
图2 Abx处理和FMT后小鼠肠道菌群的特征。通过使用细菌16S核糖体RNA（rRNA）基因扩增PCR的V4区检测未处理，Abx处理和FMT到Abx处理小鼠的粪便菌群。a粪便中前10个门的相对丰度。b粪便中四个主要门的相对丰度。c粪便中前15个属的相对丰度。d粪便中四个主要属的相对丰度。* p <0.05与每个组显着不同。
3 肠道菌群失调症小鼠的短链脂肪酸含量降低 为了确定肠道菌群对乳腺炎的保护作用是否与SCFA相关，本文评估了小鼠中SCFA的表达。如表1所示，与未治疗的小鼠相比，肠道菌群失调症小鼠的乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐含量显着降低。FMT恢复了肠道菌群失调症小鼠的乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐的浓度。
表1 粪便中短链脂肪酸的浓度
4 SCFAs对金黄色葡萄球菌性乳腺炎的影响 本文检测了SCFA（乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐）对金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎的影响。结果表明，用丙酸钠（SP）或丁酸钠（SB）进行预处理可降低血-奶屏障通透性（图3a，或图4a），乳腺损伤和炎性细胞浸润（图3b和图4b），促炎性细胞因子的产生（图3c-e或图4c-e）和乳腺中的MPO活性（图3f或4f）。在金黄色葡萄球菌感染后，未治疗的和肠道微生物菌群失调的小鼠中都存在这种情况。同时，我们发现用SP或SB治疗后，血液和乳腺组织中丙酸和丁酸的水平均升高。此外，我们还发现SP和SB不会影响金黄色葡萄球菌的生长。这些数据表明SP和SB可以通过减少炎症反应和调节血奶屏障通透性来预防金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎。此外，本文还发现用乙酸钠（SA）治疗对金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎没有保护作用（图5a-e）。
图3 丙酸钠(SP)通过调节血乳屏障的通透性来预防金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎。在金黄色葡萄球菌(1107CFU)感染前1小时，小鼠腹腔注射丙酸钠(SP, 100mg/kg)。24小时后采集乳腺组织进行检测。a在未经治疗的小鼠和肠道菌群失调小鼠感染后24小时，评估乳腺中紧密连接蛋白Occludin，Claudin-3和Occludin的水平。b对未处理组和肠道菌群失调组小鼠的乳腺组织切片并进行H&E染色(100×)。评估未经治疗小鼠和肠道菌群失调小鼠的乳腺中感染促炎细胞因子的水平,包括TNF-α(c), IL-1β(d)和IL- 6 (e)，以及MPO活性(f)。*p < 0.05差异有统计学意义。
图4 丁酸钠（SB）通过调节血奶屏障通透性来预防金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎。在小鼠被金黄色葡萄球菌（1107CFU）感染之前1小时腹膜内注射丁酸钠（SB，100 mg/ kg）。其他处理同图3。
图5 醋酸钠(SA)对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎无保护作用。在小鼠被金黄色葡萄球菌（1107 CFU）感染之前1小时腹膜内注射丁酸钠（SA，100mg/ kg）。其他处理同图3。
5 酪丁酸梭菌通过产生丁酸酯来预防金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎 本文检测酪氨酸丁酸梭菌（一种可产生丁酸的细菌）对金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎的作用。结果表明，酪丁酸梭菌显着降低了金黄色葡萄球菌诱导的血牛奶屏障通透性（图6a），乳腺病理损伤（图6b），促炎性细胞因子（ TNF-α，IL-1β和IL-6）的产生（图6c-e）和MPO活性（图6f）。上述结果表明酪丁酸梭菌通过减少炎症反应和调节血-乳屏障通透性来预防金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎。随后，为了通过细菌的潜在成分或产生丁酸来检测酪丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎的保护作用，我们评估了热灭活的酪丁酸梭菌和酪氨酸丁酸梭菌上清液对金黄色葡萄球菌的影响。诱发的乳腺炎。结果显示酪丁酸克鲁维氏菌上清液而不是热灭活的酪丁酸克鲁维氏菌减轻了乳腺的病理损伤和炎性细胞浸润（图7a），并促进了促炎细胞因子TNF-α，IL-1β，和由金黄色葡萄球菌诱导的IL-6（图7b-d）。此外，我们测量了酪丁酸梭菌上清液中的丁酸水平以及酪丁酸梭菌组小鼠的血液和乳腺中丙酸和丁酸的水平。表S2显示了酪丁酸梭菌上清液中的丁酸水平，补充酪丁酸梭菌明显增加了血液中丁酸和丙酸酯的水平以及乳腺组织中丁酸的水平。这些结果表明酪丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的保护作用可能是由于丁酸盐的产生。
图6 酪丁酸梭菌通过调节血乳屏障来预防金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎。连续7天给小鼠口服酪丁酸梭菌（1106、1107和1108 / 200 L PBS）管饲，然后用金黄色葡萄球菌（1107 CFU）感染。其他如图3。
图7 酪丁酸梭菌通过产生丁酸酯来预防金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎。连续7天给小鼠口服经热诱导的酪丁酸梭菌（1108/200 L PBS）或酪丁酸梭菌上清液，然后用金黄色葡萄球菌（1107 CFU）感染。其他如图3。
这项研究的结果表明，肠道菌群失调是宿主中导致乳腺炎严重程度的重要因素。肠道微生物群失调会导致乳腺组织形态变化并增加炎症评分以及免疫细胞水平的想法。此外，乳腺退化是一个高度复杂的多步骤过程，是一个高度动态且依赖时间的过程，会导致免疫细胞募集方面的差异。研究表明，断奶后48小时，乳腺中的中性粒细胞数量略有增加，随后巨噬细胞聚集。这些结果表明，Abx引起的肠道菌群失调似乎影响了乳腺退化的时间表。这一发现还表明，本实验模型具有某些局限性，可能会影响这一结论。此外，感染金黄色葡萄球菌后，肠道菌群失调症小鼠的炎症损伤比未治疗的小鼠明显增加。但是，对肠道菌群失调症小鼠进行FMT可以显着逆转这些变化。血奶屏障是一种特殊的结构，在保护哺乳动物的乳腺功能中起着重要的作用。血乳屏障的通透性增加导致体细胞特别是PMNs大量聚集。乳腺中PMNs的增加会加剧乳腺炎症。一些证据表明，肠道菌群在血脑屏障的形成中起着重要作用。因此，本文假设肠道菌群可能影响血奶屏障的通透性。使用Abx预先建立的营养不良会显着降低血牛奶屏障的紧密连接蛋白含量，包括Occludin，Claudin-3和ZO-1。但是，对肠道微生物生物危害小鼠进行FMT会增加Occludin，Claudin-3和ZO-1的水平。FITC-白蛋白是用于评估血乳屏障通透性的另一个重要因素。结果表明，FITC-白蛋白分布在肠道菌群失调症小鼠的肺泡腔内。但是，未治疗小鼠的肺泡腔中不存在荧光反应。FMT对肠道菌群营养不良小鼠的作用降低了FITC-白蛋白在肺泡腔中的分布。因此，肠道菌群对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的保护作用可通过调节血-乳屏障通透性而发生。为了了解在Abx给药后成功定居于肠道的细菌并确定哪些可能的肠道微生物群驱动乳腺救援表型，我们在未经治疗，Abx和FMT的Abx治疗组中检测了小鼠肠道菌群的结构。Abx处理小鼠的细菌群落结构与未处理小鼠的细菌群落结构是不同的，Abx处理后微生物群落的物种丰富度和多样性均降低，FMT对Abx处理小鼠的逆转了这些变化。进一步的分析表明，与门氏杆菌相比，属于Proteobacteria phylum的肠杆菌的丰度显着增加，而属于Fimicutesphylum的乳酸杆菌和属于Bacteroidetes phylactides的细菌的丰度显着降低。未经治疗的小鼠。FMT后对Abx组小鼠也逆转了这些变化。与我们的结果一致，其他研究也表明，用Abx进行治疗可增加肠杆菌的相对丰度，并减少扇形菌门，杆菌门菌，拟杆菌属和乳杆菌属的相对丰度。肠杆菌是一种重要的病原体，可导致许多疾病的发展，包括肺炎，大肠癌，败血症和乳腺炎。因此，经Abx处理的小鼠的肠道菌群中肠杆菌的丰度增加可能与乳腺的炎症反应有关。此外，门扇菌和拟杆菌是产生SCFA的细菌。越来越多的证据表明，肠道微生物群是维持健康的重要因素，至少部分是通过SCFA的释放来实现的，SCFA是由肠道微生物群在部分和不易消化的多糖发酵后产生的。有证据表明丙酸在宿主对细菌和真菌感染的易感性中起重要作用。最近，已证明丙酸酯可通过调节血乳屏障来预防LPS诱发的乳腺炎。证据还表明，SCFA，尤其是丁酸，在调节炎症反应中起着重要作用。另一方面，丁酸盐调节小肠细胞的生长和分化并诱导小肠中的血管生成。最重要的是，丁酸盐是诱导紧密连接蛋白表达的最重要的营养素。这些发现表明，SCFA参与了血液-牛奶屏障的形成。实验数据表明，肠道微生物群失调小鼠FMT后，乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐水平显着降低，SCFAs表达得以恢复。此外，在金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎的背景下，用丙酸钠（SP），丁酸钠（SB）而不是乙酸钠（SA）预处理的小鼠通过增强未经治疗的小鼠和肠道菌群的血乳屏障功能来减轻炎症生物标志物失调小鼠。为了进一步研究SP和SB抑制病理的机制，本文评估了血液和乳腺中丙酸和丁酸的水平以及SP和SB对金黄色葡萄球菌生长的影响。研究表明，SP或SB治疗后血液和乳腺中的丙酸和丁酸水平均升高。此外，SP和SB均不影响金黄色葡萄球菌的生长。结果表明，SP和SB对金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎的保护作用是通过抑制维持血乳屏障通透性的促炎性免疫应答而发生的。最后，本文用产生丁酸盐的细菌（酪氨酸丁酸梭菌）处理了动物，并观察到了对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的保护作用。酪丁酸梭菌存在于肠道中，并通过调节肠道微生物群代谢产物（如丁酸盐）而在防御病原菌方面具有保护作用。我们还发现酪丁酸梭菌降低了牛奶屏障的通透性并减轻了金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎症。有人认为，肠道菌群的代谢产物对于控制远处器官的炎症很重要。其他支持证据表明，酪丁酸梭菌治疗可通过调节缺血再灌注诱导的急性肾损伤期间的炎症过程来改善肾脏功能。为了阐明酪丁酸梭菌对乳腺炎的保护机制，通过小鼠口服热灭活的酪氨酸丁酸梭菌和酪丁酸梭菌上清液，然后感染金黄色葡萄球菌诱导乳腺炎。有趣的是，酪氨酸丁酸梭菌上清液不能热灭活酪氨酸丁酸梭菌抑制金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎。另外，接受活酪丁酸梭菌的小鼠的血液和乳腺中的丁酸盐含量也显着增加。此外，结果表明SP的施用不仅提高了乳腺中丙酸的浓度，而且还提高了丁酸的浓度。该结果可能与添加丙酸酯促进丁酸酯的合成有关。其他研究证明了丙酸发酵的存在，而丁酸是通过丙酸碳链的延长而合成的。此外，SB和SP给药后，乳腺组织中的丁酸和丙酸的浓度高于循环血浆中的浓度，这可能是由于大量的丁酸和丙酸与血液一起进入乳腺并在乳腺中积累。
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