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编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 高浓度抗生素的生物废水处理体系可以诱导和选择抗生素抗性。然而，对于废水处理过程中造成抗生素耐药性选择的最低抗生素浓度还鲜有研究报道。在此，历经606天通过向生物膜型污水处理系统中加入一定剂量（0.1, 1, 5, 25, 50 mg/L）的各类抗生素研究了影响土霉素、链霉素和螺旋霉素耐药性选择的最低抗生素浓度。综合运用定量PCR、16s扩增子测序、宏基因组测序和平板涂布培养法分析了抗生素抗性基因、可移动遗传元件丰度和细菌群落抗性。 根据宏基因组测序结果，0.1 mg / L链霉素和土霉素使抗生素抗性基因丰度显著增加，而导致耐药细菌比例显著增加的链霉素最低浓度为5 mg / L、土霉素为25 mg / L。虽然抗性基因丰度随着螺旋霉素剂量的增加而增加，但大环内酯-林可酰胺-链球菌素(MLS)耐药基因和耐药细菌的比例均未见明显增加。典范对应分析表明，在链霉素和土霉素存在的情况下，细菌群落和可移动遗传元件的改变都促进了抗性基因的富集。螺旋霉素主要以革兰氏阳性细菌为靶点，而生物膜菌群中以本身具有抗性的革兰氏阴性菌为主，这可能是导致螺旋霉素胁迫下MLS耐药基因变化不明显的主要原因。结果表明，在废水处理过程中将链霉素和土霉素浓度控制在0.1 mg/L以下，可防止产生抗生素耐药性，为抗生素废水的管理提供了科学依据和研究思路。 论文ID 原名：Minimum influent concentrations of oxytetracycline, streptomycin and spiramycin in selecting antibiotic resistance in biofilm type wastewater treatment systems 译名：土霉素、链霉素和螺旋霉素在生物膜型废水处理系统中选择耐药的最低进水浓度 期刊：Science of the Total Environment IF：5.589 发表时间：2020.02 通信作者：杨敏 通信作者单位：中国科学院生态环境研究中心 实验设计 本实验构建了4个反应器(15×10×29.5 cm)，每个反应器填充18个直径为2 cm的纤维球，注入取自城市污水厂的污水，水力停留时间24小时，黑暗条件下持续加入含葡萄糖、淀粉、胰蛋白胨和羧甲基纤维素钠为碳源（即抗生素生产废水成分）的废水（投入抗生素前每天制备COD浓度为400 mg/L和氨浓度为34 mg/L的合成废水）。为了保证实验的准确性，每天对反应器中的pH值和溶解氧浓度进行检测，并对出水COD和氨浓度进行常规监测，追踪废水处理性能。四个反应器中的三个分别加入土霉素OTC、链霉素STM和螺旋霉素SPM，另一个作对照。将250 mg的目标抗生素溶解于25 mL的超纯水中，制备浓度为10000 mg/L的抗生素原液。将其添加到废水中，剂量由0、0.1、1、5、25到50mg/L依次增加，反应器至少运行三个月后再进入下一个抗生素剂量的阶段。每两天收集一次进出水的废水样本进行常规分析，测定COD和氨的浓度。每个阶段结束时，从加入抗生素反应器的进水和出水中各取三份水样用超高效液相色谱串联质谱法测定抗生素浓度。在每个阶段的最后三周，每周从反应器中取出纤维球进行生物学分析，再放回新纤维球。从同一反应器中收集的三个小球视为平行样品，将每个小球放入50 mL磷酸盐缓冲液中，摇5分钟，在4℃下以10000rpm离心10min以收集微生物。将上清液倒回瓶中再次清洗小球，重复至少20次至小球恢复原来的乳白色。收获的生物量分为两部分，一部分直接存放在- 80°C冰箱以备分子生物学分析，另一部分储存在25%的甘油中，再放入- 80°C冰箱，留待耐药细菌比例的测定。 提取DNA后用引物515F和907R进行16S扩增子Illumina高通量测序，并将三个平行样品混合后进行宏基因组测序以获得其中抗性基因和可移动遗传元件的丰度信息，换算为单位16S拷贝所携带的拷贝数，并分析抗性基因在质粒上的分布情况。用SYBR-Green定量PCR测定7种四环素抗性基因tetA、tetC、tetG、tetL、tetQ、tetW、tetX，8种氨基糖苷类抗性基因aac(3)-II、aac(6′)-I、ant3ia、ant2ia、ant6ia、aph(3′)-I、aph(3″)-I、aph(6)-Id，6种MLS抗性基因rmB、ermF、ermX、ereA、mphB、mefA，可移动遗传元件intI1和16s基因的拷贝数。经TA克隆提取质粒后，用Nanodrop ND-1000测定质粒浓度用于制作标准曲线。用传统的涂布平板计数法测定抗生素抗性细菌比例，取出-80℃冰箱中的菌液37℃下震荡培养半小时后用0.9%氯化钠溶液进行10倍稀释，取100 μL进行平板涂布以得到异养细菌总数。三种抗生素抗性细菌含量分别由加入了OTC (16 mg/L), STM (64mg/L)和SPM (32 mg/L)的TSA平板涂布计数所得。不同处理组和各阶段样品的数据在SPSS中进行相关分析和方差分析；用Excel和Origin绘图；用R 2.13.1中的vegan包进行典范对应分析；进行抗生素抗性基因和细菌物种间的网络分析后用Gephi软件进行可视化。 结果 1 生物膜反应器性能 三个含抗生素反应体系和对照组在整个实验周期内的COD去除率相对稳定(82.61%至93.85%)，抗生素残留物和降解产物的贡献使加入抗生素的废水出水COD浓度略有增加。对照组一直硝化性能稳定，而在抗生素浓度为50 mg/L时，STM和OTC体系硝化作用被完全抑制，进出水氨氮浓度(34mg/L)基本一致，这与以往研究中STM和OTC对硝化微生物具有较强抑制作用的结论相一致。50 mg/L SPM初始对硝化作用产生抑制，但随后恢复，这可能是由于高浓度螺旋霉素时氨氧化古菌会适应环境条件。另一方面，随着抗生素剂量从0.1增加到50mg/L，SPM和OTC的出水浓度分别从0.034 mg/L和0.016 mg/L增加到17.03 mg/L和27.38 mg/L。相反，STM的出水浓度始终低于0.025 mg/L。 2 不同抗生素剂量下抗性基因丰度变化 图1比较了加入三种抗生素的反应体系与对照组的抗性基因丰度变化情况。随着抗生素剂量的从0增加到50 mg / L，SPM、STM和OTC抗性基因丰度分别从(3.40×10−1±3.00×10−3)，(3.03×10−1±8.00×10−3)和(3.56×10−1±1.30×10−2)/16srRNA增至9.61×10−1±4.30×10−2，1.06×100±1.33×10−2和1.83×100±2.89×10−2。而对照组则在3.35×10−1±1.01×10−3和2.38×10−1±5.69×10− 3范围内变化。抗生素浓度为0.1 mg/L时，STM和OTC反应体系中抗性基因丰度均显著增加。对于SPM反应体系，其浓度为5 mg/L时抗性基因丰度即有所增加，但后期(50 mg/L SPM)反而减少。四反应器中未加抗生素的初期主要含有磺胺类、氨基糖苷类、四环素类和多药抗生素抗性基因。STM和OTC反应体系富集了磺胺、氨基糖苷和四环素类ARGs，而50mg /L SPM反应体系富集了多药ARGs。 共检测到28种四环素、24种氨基糖苷和19种MLS抗性基因。如图2所示，1mg/L OTC体系中四环素抗性基因即显著增多，且以三种编码外排泵的基因tetA、tetC和tetG为主（图3）。当STM浓度为1 mg/L时，该反应体系中氨基糖苷类ARGs也显著增加，主要有aph(6)-Id、aph(3”)-I和ant3ia三种降解酶基因。SPM处理组中MLS ARGs的相对丰度远低于OTC或STM 组中四环素或氨基糖苷类ARGs的相对丰度。尽管0.1 mg/L SPM时MLS ARGs丰度显著增加，富集了ermB、mefA和ereA基因，它从第四阶段(5 mg / L SPM)开始减少，并在最后阶段(50 mg / L SPM)通过增加编码大环内酯外排泵的macB基因含量再次升高。然而值得注意的是，macB仅对14和15环-内酯具有抗性，因此这个基因可能不会对螺旋霉素（16环-内酯）有抗性。利用SYBR-Green qPCR进一步验证了上述三种抗性基因的变化。除了富集自身的抗性基因，OTC和STM也增加了其他方面耐药性(图3)。OTC剂量的增加富集了氨基糖苷类(aac (6′)-I、aac (3)-II、ant3ia、ant2ia、aph”(3) - I、aph (6) id)，磺胺类(sul1)，氯霉素(catB、cmlA、floR)，氟喹诺酮类(qnrS、smeB)等抗性基因。STM富集了磺胺(sul1)、氯霉素(catB)、万古霉素(vanX)和四环素(tetG, tetM)类ARGs。在50 mg/L SPM体系中富集了多药(acrB、ompR、mexF、mdtB和mdtC)、磷霉素类(rosB)和杆菌肽(bacA)等ARGs (图3)。 图2 相应抗生素抗性基因丰度变化。抗生素剂量：阶段1：0 mg/L，阶段2：0.1 mg/L，阶段3：1mg /L，阶段4：5 mg/L，阶段5：25mg /L，阶段6：50 mg/L，(*)p<0.01。 图3 整个实验期间好氧生物膜微生物区系中平均丰度>0.0001的抗性基因的变化情况。 颜色深浅表示经对数转换后的拷贝数的多少。 3 不同抗生素剂量下抗性细菌比例变化 第一阶段OTC抗性细菌占比高达42.94%，25mg/L OTC时上升至100% (图4)。STM耐药细菌比例在前三个阶段(0、0.1、1mg/L STM)低于10%，在5 mg/L STM浓度下显著升高至约40%。随着SPM浓度升高，SPM抗性细菌的比例并没有增加的趋势，而是整个实验期间都在32% ~ 54%之间波动。 图4 基于平板计数的培养方法揭示了SPM、STM和OTC耐药菌比例在不同阶段的变化。 4 细菌群落变化 通过miseq测序共获得高质量序列4,232,357条，聚类为4907OTU。三个加入抗生素的反应体系中微生物多样性均降低(Shannon指数)。四个反应器中初始菌群相似，随着抗生素剂量的增加，菌群组成出现分化。聚类分析显示，反应体系中OTC浓度为0.1 mg/L时细菌群落开始发生显著变化，而另两类抗生素反应体系中细菌群落则在1mg/L剂量时才开始发生显著变化。SPM反应体系中革兰氏阳性细菌的相对丰度从3.31%上升到22.30%（随着SPM从0到1 mg / L），然后下降到11.27% (50 mg / L SPM时)，而其他三个反应体系在整个实验过程中以革兰氏阴性细菌为主(>91%)。在细菌群落组成上，4个反应体系中变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌、绿弯菌门(67.62% ~ 96.94%)为优势物种(图5a)。属水平上，四个反应体系开始以黄色单胞菌(10.26%–16.67%)、厌氧绳菌(12.14%–16.67%)、溶杆菌属(3.99%–5.94%)、未知从毛单胞菌(3.00%–5.94%)为主；在阶段6，对照组以菌根菌属(8.97%)、赤霞珠属(8.60%)、毛球菌属(8.27%)、赤霉菌属(6.96%)和孢粉念珠菌属(6.59%)为主；STM反应体系以腐霉科未培养菌(67.88%)、PHOS-HE36菌(4.76%)为主；OTC反应器体系以菌根菌(16.79%)、厌氧阴沟菌 (10.72%)、硫杆菌属(5.55%)、胞外菌科未培养菌(4.98%)和雷氏菌属(3.02%)为主。 图5 不同抗生素胁迫下好氧生物膜菌群和功能基因的变化。 (a) 门水平细菌群落组成，(b)可移动遗传元件的丰度，(c) STM体系中氨基糖苷类ARGs与细菌各属的关联分析，(d) OTC体系中四环素类ARGs与细菌各属的关联分析。ISs：插入序列，Blank1~6表示对照组的不同阶段。 同时，通过宏基因组测序也揭示了生物膜中微生物群落变化。经BLASTx比对本地INTEGRALL数据库发现，所有与整合子相关的序列都与intI1有很高的相似性。如图5b所示，对照组中intI1相对丰度呈下降趋势，而在SPM和STM 处理组中则呈上升趋势，OTC组中先从4.19×10−2±1.83×10−3增加到4.16×10−1±2.23×10−3 (5mg/L OTC)，然后逐渐减少到1.41×10−1±1.37×10−3(50 mg/L OTC)(图5b)。通过SYBR-Green定量PCR进一步证实了intI1的丰度变化。质粒相对丰度在对照组中也有所下降，在三个抗生素反应体系中其变化规律与intI1相似(图5b)。进一步分析质粒上的ARGs，对照组和SPM组中含有抗性基因的质粒片段分别从35和51减少到25和30，说明质粒可能对该体系中ARGs变化的作用不大。相反，STM和OTC体系下，随着抗生素剂量从0 mg/L增加到50 mg/L，含抗性基因的质粒片段数量分别从32和24增加到49和85。一些为人熟知的质粒上的ARGs，如tetG、sul2和aph(6)-Id，这里也发现是由质粒携带。同时还发现加入抗生素后有不同ARGs出现在同一质粒上。例如，OTC处理组四环素外排泵基因tetA、氯霉素乙酰转移酶基因catB、D类β-内酰胺酶基因OXA-1聚集到了pEcNDM0质粒上。 利用典范对应分析将细菌群落和可移动遗传元件的变化对于ARGs的影响进行量化发现，对照组中细菌群落和可动遗传元件分别解释了抗性基因变化的16.67%和10.03%，SPM组为22.93%和14.10%，STM组为27.35%和21.39%，OTC组为32.47%和38.25%。同时，网络分析和基于宏基因组的分箱共同揭示了ARGs的潜在细菌宿主。网络分析显示，STM组中腐螺旋菌、硫杆菌和柄杆菌与aph(6)-Id相关，而ant3ia可能由Rhizomicrobium携带(图5c)。OTC组中，屈挠杆菌是tetA和tetG基因的潜在宿主，而假单胞菌和Dechloromonas可能携带tetC(图5d)。OTC组中的tetA基因可能由鞘脂单胞菌、氏菌和根瘤菌携带，SPM组中的MLS基因(mefA、ermW、srmB和erm39) 可能由放线菌门的细菌携带。 讨论 结合基因型和表型分析，揭示了在606天内逐步增加SPM、STM或OTC抗生素剂量后废水生物处理系统中抗生素抗性基因、可移动遗传元件和耐药菌比例的演变。考虑到微生物对抗生素胁迫的适应性，本研究采用长期慢性试验，更接近于废水处理厂实际情况。宏基因组测序和定量PCR结果均表明，随着抗生素STM和OTC剂量增加，0.1 mg/L时其相应ARGs即开始增多。尽管起始抗生素剂量更高，平板计数实验也显示出剂量-效应关系，这可能与试验中抗生素断点浓度的选择有关。研究发现10μg / L四环素可以显著增加水体生物膜中四环素耐药细菌丰度，10-100μg / L四环素可以显著富集抗性基因(tetM、tetO、tetQ、tetW)。由图2，0.1 mg/L和1.0 mg/L OTC分别可使tet丰度增加30.62%和381.52%。该课题组前期研究表明，采用优化水解工艺：pH(7)、温度(85℃)、6h，污水中OTC可从约1000 mg/L降至0.1 mg/L以下。因此，将制药行业废水的OTC最小进水浓度设置为0.1mg/L，有利于防止ARGs扩散。氨基糖苷类抗生素的相关信息比较匮乏，综合考虑氨基糖苷类ARGs和其耐药菌含量，将STM的最小进水浓度也设置为0.1 mg/L。尽管SPM剂量为5 mg/L时，抗性基因丰度显著增加，MLS ARGs或SPM耐药菌并没有明显的剂量-效应关系(图2和图4)，原因稍后讨论。 对应分析表明，在STM和OTC的胁迫下细菌群落和可移动遗传元件的改变均促进了ARGs的增加，生物废水处理系统中显著富集了相应的ARGs。如图3，STM处理组中增加的氨基糖苷类ARGs主要为编码磷酸转移酶(APH)或核苷酸转移酶(ANT)的aph(6)-Id、aph(3”)-I和ant3ia基因。aph和ant基因在水体中广泛分布，且可能与本研究中STM高去除率有关，这些降解酶基因帮助宿主细菌在STM胁迫中存活下来，如硫杆菌等(图5 c)。同时，通常嵌入intI1可变区域的aph(6)-Id、aph(3”)-I、ant3ia、ant2ia、aac(3)-IIIa、aph(3’)-I、aac(6’)-I与intI1含量之间也存在显著相关性，STM胁迫下intI1的增多(图5b)或可促进抗性基因的水平转移。在OTC选择压力下，编码外排泵的tetA、tetC和tetG基因被迅速富集，这些基因不同于编码降解酶的aph和ant基因，他们似乎只对其宿主有利，且在极低OTC浓度下即被选择下来。研究发现，含四环素或土霉素的活性污泥中，这些编码外排泵的基因被优先富集。他们的潜在的细菌宿主，如屈挠杆菌，白塞菌，根瘤菌和假单胞菌(图5d)，在OTC反应体系中发生明显富集。tet基因通常由转座子和质粒携带，因此，在OTC胁迫下，可移动遗传元件的富集(图5b)也可能使主要tet基因有所增多。需要通过分离耐药细菌和基因组测序，以进一步明确STM和OTC胁迫下intI1、转座子和质粒在抗生素抗性形成中的作用。 有趣的是，其他非STM或OTC抗性的ARGs也在STM或OTC选择下被富集。在STM反应体系中，多数非氨基糖苷类ARGs的富集，如catB和sul1(图3)，可归因于其负载于intI1。关于tetG的富集，可能因该基因存在于intI1侧翼含ant3ia的插入序列公共区域，当STM浓度增加时，它们可能一起被选择下来。OTC反应体系中，tet基因与其他ARGs在质粒上线性共存可能是产生多药抗性的重要原因，质粒携带的tetA、tetC和tetG通常与其他ARGs具有同源性。本研究还在OTC组中检测到源于肺炎克雷伯菌的质粒p1（含tetG、cmlA和sul1基因）、质粒pEcNDM0（含tetA、catB和OXA-1基因）、pNDMCFuy质粒（含tetC和aac(6 ')-I基因）。与OTC和STM不同，SPM主要抑制很少出现在好氧生物膜中的革兰氏阳性菌，像ermB和mefA这样的MLS ARGs通常由Arcanobacterium、Bacillus、Clostridium和Mycobacterium等革兰氏阳性菌携带。而本研究通过宏基因组分析，也证实了革兰氏阳性放线菌携带含量丰富的mefA基因和罕见MLS基因(ermW、srmB、erm39)。该课题组前期工作发现厌氧污泥处理过程中，螺旋霉素生产废水能筛选MLS抗性，其中77.1%为革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌可以在高浓度SPM环境中存活，因为他们可以通过核糖体变异对SPM产生固有抗性，增加细胞壁的脂多糖或外排泵的表达。所以实验过程中占多数比例的革兰氏阴性菌，可能是导致MLS基因丰度低、变化不明显的原因 (图2)。 考虑到微生物群落组成结构的差异，本研究采用长期慢性暴露实验得到的生物膜型废水处理系统中产生抗性细菌的抗生素最低浓度：OTC (进水0.1 mg/L，出水0.016 mg/L），STM(进水0.1 mg/L，出水≤0.001 mg/L)或许不能直接用于推测其他条件下抗性形成机制。对于不同进水抗生素浓度体系，如直接暴露于50mg /L剂量，抗生素耐药性形成过程还有待进一步研究以验证此处的最小进水浓度。此外，需要在抗生素污水处理厂进行后续研究来验证这里的OTC和STM最小浓度，并得到其他抗生素的最低进水浓度。 结论
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