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编译：你知道，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 肠道菌群合成数以百计的分子，其中许多都会影响宿主生理。在最丰富的代谢产物中，有次级胆汁酸脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA），已知它们能以约500μM的浓度积累阻断Clostridium difficile的生长，促进肝细胞癌并通过G蛋白偶联受体TGR5调节宿主代谢。更广泛地说，DCA，LCA及其衍生物是胆汁酸循环池的主要组成部分。该池的大小和组成是原发性胆源性胆管炎和非酒精性脂肪性肝炎的治疗目标。尽管如此，虽然DCA和LCA对宿主生理有明显影响，但是对其生物合成基因的不完全了解以及缺乏能够对其天然微生物生产者进行修饰的遗传工具，仍然限制了我们调节宿主中次级胆汁酸水平的能力。 本文通过为定性和分配在还原臂的每个步骤中的酶来完整DCA和LCA的通路，揭示了在类固醇核心的A–B环在进行的两个还原步骤中被瞬时转化为电子受体的一种战略，通过Fe-S黄素酶进行两个还原步骤。使用厌氧体外重建，我们确定一组六种酶对胆酸到DCA的八步转化是必要和充分的。然后，我们将该途径工程化为Clostridiumsporogenes，赋予非生产共生体生产DCA和LCA的能力，并证明微生物组衍生的途径可以被异源表达和控制。这些数据建立了通往胆汁酸池两个主要成分的完整途径。 论文ID 原名：A metabolic pathway for bile aciddehydroxylation by the gut microbiome 译名：肠道微生物对胆汁酸去羟基化的代谢途径 期刊：Nature IF：42.778 发表时间：2020.06 通讯作者：Steven C. Almo& Michael A. Fischbach 作者单位：美国加利福尼亚州斯坦福市，斯坦福大学生物工程与化学工程学系;美国纽约州布朗克斯，阿尔伯特·爱因斯坦医学院生物化学系 实验设计 结果 1 7α脱羟基的重建 我们首先着手取消在7位-去羟化途径的其余步骤。由于之前的研究涉及到bai酶在大肠杆菌中单独表达，因此我们认为，在体外对酶进行纯化、混合和检测的替代方法，可以帮助描绘出一组足以进行7α-去羟基化的必要酶。考虑到8基因的bai操纵子在所有已知的7 α-羟化菌株中都是相同的，我们将精力集中在操纵子编码的酶上。我们克隆了每个酶的三个同源物，在微氧条件下分别在大肠杆菌中表达，并厌氧纯化为氨基末端His6融合物。使用这种策略,我们获得至少一个可溶性, 纯化每一个bai酶的orthologue(扩展数据图2)。当我们孵化一个提纯bai酶与胆酸的混合物时,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) +,辅酶a和ATP在厌氧条件下和监控反应通过液相色谱与质谱联用(LC-MS),我们观察到的时间依赖的胆酸到DCA的转换,表明BaiB, BaiCD,BaiA2, ,BaiF的结合以及BaiH的简化足以进行7α-去羟基化;不需要额外的酶(图2a, b)。 图2 体外建立完整的7α-羟化通路 扩展图2重组Bai蛋白的纯化 a，经过Ni亲和和大小排除纯化后的Bai蛋白的SDS- PAGE分析，考马斯蓝染色显示。该图像使用Bio-RadGel Doc Universal Hood II分子成像仪生成。MWM，分子量标记;来自C. scindens的BaiB;2、来自C.hylemonae的BaiB;3、来自C. hiranonis的BaiCD;来自C. scindens的BaiE;来自C. hiranonis的BaiE;来自C. scindens的BaiA2;7、来自C.hylemonae的BaiF;来自C. scindens的BaiH;来自C. scindens的BaiI;来自C. hiranonis的BaiI。b，紫外可见光谱，左为24μM，右为13μM。在370 nm和450 nm处的特征表明黄素与BaiCD和BaiH结合，并且部分被具有300 nm到700 nm广泛吸光度的[4Fe 4S]簇的存在所掩盖。c，经质谱分析证实FMN和FAD的存在。c区实验独立重复两次，结果相似。 为了验证我们关于该途径步骤顺序的假设，我们进行了逐步重建，每次添加一种酶，并允许中间产物在该途径中的每一步完成(图2c)。从这些数据中，我们得出两个结论。首先，在重组过程中使用的六种酶不仅是充分的，而且是必要的，其途径按照图2c所示的方案进行。我们直接观察到质量离子与每一个提议的中间产物一致，为先前提出的生物合成路线的部分提供直接证据。(有关数据，请参阅补充表1及扩展数据图3， 扩展图3 胆汁酸标准品 a，对于研究中我们有真实标准的每个化合物，我们展示真实标准和实验观察到的化合物的EIC。因为这里显示的数据是从不同时间运行的样品中收集的，保留时间的漂移可能是造成保留时间不相同的峰对的原因。b，我们观察到在图2c所示的实验收集的LC-MS数据中保留时间有漂移。对于来自该数据集的两个代表性化合物，我们显示了实验观察化合物的EIC和一个真实的标准同时运行，表明保留时间与我们的峰的分布保持一致。 以支持我们的临时的结构分配;两个重要的限制是，我们对所有中间体没有真正的标准，以及LC-MS区分胆汁酸异构体的能力是有限的。尽管其保存在所有已知的去羟化物种中，但是BaiI在体外胆酸去羟化是不可缺少的。BaiI是预测Δ5-ketosteroid异构酶,它可以处理除了胆酸以外的底物,大概有4、5或5,6-烯烃的底物。 其次，令我们惊讶的是，BaiH的缺失导致通路在高氧化中间体3-oxo-4,5-6,7-dehydro-DCA处停滞，而其加入则导致连续两次2e-还原形成3-oxo-DCA。此前曾有人提出BaiH可氧化一种替代底物，3-oxo-4,5-dehydro-ursodeoxycholicacid，因此在该途径的还原臂中可能发挥的作用是意料之外的。为了进一步探索这一发现，我们将纯化的BaiH与合成3-oxo-4,5-6,7-dehydro- DCA孵育;我们观察到酶催化2 e-转为 3-oxo-4,5-dehydro-DCA,但没有进一步减少中间(扩展数据图4)。值得注意的是,3-oxo-4, 5-dehydro-DCA并不建立在包含BaiH的重构反应中,暗示混合物存在另一种酶催化第二个还原步骤。假设,BaiH同系物BaiCD催化第二还原步骤,我们与它合成的3-oxo-4 5-dehydro-DCA孵育,揭示了它将底物拆合到3-oxo-DCA(扩展数据图4)。 扩展图4 BaiCD和BaiH 的动力学参数 a, Michaelis–Menten分析了通过BaiCD将3-氧-4,5-脱氢- DCA转化为3-氧- DCA的过程。反应混合物包含0.45μM BaiCD和1毫摩的NADH，底物浓度在15μM和500μM之间变化。b, Michaelis–Menten分析了通过BaiH 将3-氧-4,5,6,7-二氢- DCA转化为3-氧-4,5-dehydro-DCA的过程。反应混合物包含0.45μM BaiH和1 mM的浓度NADH，底物浓度在3和100之间变化。数据显示产物平均水平±1s.d。（三个生物学重复） 综上,这些数据表明,该通路使用一个不寻常的氧化还原策略的A和B环类固醇核心转换成一个高度氧化中间产物3-oxo-4,5 - 6, 7-didehydro-DCA;这两个关键的还原步骤是由Fe-S黄素酶超家族中的两种同源酶BaiH和BaiCD催化完成的。 最后，3-oxo-DCA还原为DCA途径的最后一步是由BaiA2完成的，经纯化的BaiA2单独测定证实(扩展数据图5)。 扩展数据图5 BaiA2对3-oxo-DCA还原的生化分析 通过重新结合BaiA2与结合EICs表明3-oxo-DCA通过重组转化为DCA。这个实验做过一次。 因此，BaiA2和BaiCD在该途径中均作用两次，催化其前两个氧化还原步骤和最后两个氧化还原步骤。 2 设计到C.sporogenes的通路 在确定了该途径所需和足够的一组酶之后，我们试图获得对该途径的遗传控制，作为工程肠道菌群胆汁酸输出的第一步。首先，我们试图利用ClosTrongroup II内含子系统构建本地生产C.scindens的baiCD基因突变;然而，我们没有成功，因为我们不能通过共轭连接引入DNA构建到C. scindens上。作为一种替代方法，我们考虑在无法进行7 -羟化的肠道共生体中表达bai通路;然而，值得注意的例外是在Clostridium中转移途径的方法尚不完善。据我们所知，没有一条从一种Clostridium到另一种的途径还没有在人类微生物组动员的途径。 我们选择了C.sporogenesAmerican Type Culture Collection (ATCC)菌株15579作为受体，原因有二:与C. scindens相关，可能满足该通路的辅助代谢需求(例如，辅助因子生物生成);基因工具的发展使质粒转化成C. sporogenes。我们最初试图将8个基因的全部bai操纵子(baiB baiI)克隆到E. coli–C.sporogenes穿梭载体中，但未能克隆出具有完整操纵子的克隆。考虑到簇内可能存在对大肠杆菌有毒的基因，我们在不同启动子的控制下克隆了簇内的不同片段 (详见补充表2)，最终设法把集群分为三部分,每一个在它自己的大肠杆菌c sporogenes穿梭载体:baiB baiF在pMTL83153(pMF01),baiG在pMTL83353(pMF02),baiH–baiI 在pMTL83253 (pMF03) (图3a 和扩展数据图 7). 图3 将7α-去羟基化途径转入C. sporogenes a,我们将bai操纵子分为三个质粒:pMTL83153中的baiB baiF(质粒1，或pMF01)， pMTL83353中的baiG(质粒2，或pMF02)和pMTL83253中的baiH baiI(质粒3，或pMF03)。我们将pMF01、pMF02和pMF03依次偶联到C. sporogenes ATCC15579中，得到MF001。b，结合EICs显示，MF001与含有baiG转运体的C. sporogenes对照菌株(MF012)相比，将胆酸转化为DCA。这个菌株用1μM胆酸培养72 h，丙酮提取，LC-MS检测，星号指示为isoDCA。实验独立重复3次，结果相似。结合EICs显示了胆酸由MF001转化为DCA的时间依赖性。该菌株在1μM胆酸中生长，对所示时间点的氨基酸进行分析，如b所示。该实验独立重复两次，结果相似。d, 顶部，简化了胆酸的7e -去羟基化生成DCA的途径，包括本文观察到关闭了此途径水解产物。底部，操纵子单基因缺失的C.sporogenes产生的DCA、途径中间体和衍生物经LC-MS分析离子丰度(如图左侧所示)。条形图表示三个独立生物重复的平均值。e，结合EICs显示 C. sporogenes +baiG/baiH将3-oxo-4,5-6,7-didehydro-DCA转化为3-oxo-4,5-dehydro-DCA(左)，C. sporogenes +baiG/baiCD将3-oxo-4,5-dehydro-DCA转化为3-oxo-DCA(右)。每个菌株都与合成3-oxo-4,5,6,7-didehydro-DCA(左)或3-oxo - 4,5-dehydro-DCA(右)做72 h培养并在b中显示提取分析的结果。部分灰痕迹已经扩大了十倍,让它更容易想象相对应于3-oxo-DCA和DCA的峰值。实验独立重复两次，结果相似。 扩展图7 在C. sporogenes中表达bai操纵子及其部分的|结构 每个质粒都有大肠杆菌和梭状芽胞杆菌的复制起点(origin和repH)、使连接质粒转移的traJ基因和一个耐抗生素基因(catP、aad9或ermB)。在fdx或spoIIE启动子的控制下，将bai基因导入这些质粒。利用pmtl83153质粒进行baiCD和baiH功能的遗传分析。 将pMF01和pMF03中的基因置于C. sporogenes ATCC15579的spoIIE启动子下，该启动子在Clostridium生长后期中表达，而pMF02中的baiG则由强fdx启动子驱动。我们将这些质粒依次连接到C.sporogenes中，得到了MF001菌株。 当与胆酸孵育时，MF001以时间依赖的方式产生DCA，与仅含有转运体(baiG) 的对照株形成鲜明对比(图3b, c)。此外, MF001将CDCA转化为LCA(扩展数据图6)。 扩展数据图6 体内CDCA的7α-去羟基化 结合EICs显示，与含有baiG转运蛋白(MF012)的C. control菌株(C. controlstrain)相比，带有三个质粒完整bai蛋白操纵子的C. sporogenes菌株(MF001)可将CDCA转化为LCA。。用1μM胆酸培养72 h;采用高效液相色谱/质谱联用技术对培养上清中的丙酮提取物进行了分析。单个星号表示isoLCA;用双星号表示的峰为isoCDCA。这个实验做过一次。 这些数据表明，核心bai簇中的8个基因(图1)足以将胆汁酸7α-去羟化作用赋予C. sporogenes，尽管它们不排除一个或多个内源性基因的参与c .sporogenes识别通路中的分支点。 图1 结构图显示了bai操纵子和7α-去羟基化 a,bai操纵子由8个基因组成:7个编码酶，第8个baiG编码转运体。它在已知的7种细菌中保守，且其基因产物已与途径中的特定步骤相连系。HSDH,hydroxysteroid脱氢酶。b, 胆酸去羟基化生成DCA的简图。 为非天然途径的产物生物合成发现潜在的非分支点,我们构造一组八个基因均被单独删除的菌株(扩展数据图7)。我们将这些菌株与胆酸共培养并且分析培养上清液中积聚的中间体(图3 d)。正如预期的那样，该途径氧化臂基因的缺失导致了早期途径中间产物的形成。两个例外是baiE突变体，只产生cholyl-CoA;而在baif缺失的菌株中，产生了少量的最终产物DCA，说明可能存在补偿性CoA水解酶，或者CoA硫酯在体内存在一定程度的非酶水解。 有趣的是，baiH突变体在还原臂中积累了一种关键的中间体，3-oxo-4,5-6,7-didehydro-DCA(图3d)，这支持了我们的发现，baiH催化该途径的第一个还原步骤。此外,菌株C. sporogenes表达BaiG/ BaiH和BaiG/ BaiCD转换,分别转换3-oxo-4, 5 - 6,7-didehydro-DCA 到3-oxo-4,5-dehydro-DCA和转换3-oxo-4,5-dehydro-DCA到3-oxo-DCA(图3 e),提供不积聚在C. scindens培养液中的中间体的途径。值得注意的是，完全氧化和部分还原的中间产物是产生allo(5α)胆汁酸的分支点，它们具有重要的生物活性，包括诱导调节性T细胞。因此，通过在一种替代肠道微生物中表达获得对该途径的遗传控制，为合理和有意地控制胆汁酸代谢和具有独特生物学特性的替代分子的产生提供了机会。 3 小鼠中定殖C.sporogenes工程菌 最后，我们给无菌鼠定殖MF001来印证它是否会在宿主体内产生途径产物。我们另外两个实验组:作为阴性对照，单克隆的C. sporogenes和baiG (胆汁酸转运体)定殖的无菌小鼠;作为阳性对照，用野生型单克隆C. scindens定殖的无菌小鼠，C. scindens是一种含bai操纵子(7α -羟化)菌株。如图4所示，工程化的C. sporogenes和baiB I菌株(MF001)将DCA的产生赋予了宿主。生产水平大大低于C.scindens观察到的水平;我们怀疑这是由于需要包含额外的基因，目前还不知道，结合一个减少的辅助因子池的通路，增加通量。尽管如此，我们的数据为胆汁酸池的研究与工程设计提供了一个重要的起点。
图4 7α-去羟基化途径的体内活性 将含有载体baiG(MF012菌株)、含有baiB baiI (MF001菌株)的C. sporogenes和天然的7α-脱氧C. scindens进行单克隆。在第6天获取粪便，用LC质谱分析，以确定宿主源底物胆酸和途径产物DCA的数量。p值由双尾t检验确定;NS,无差异。盒须图显示了中位数、第25个75个百分位数和n = 4- 7个独立生物重复的范围。 4 来自微生物组的工程途径 我们的结果揭示了完整的胆汁酸7α -去羟基化途径，使其更接近我们对内源性人体代谢途径的认识水平。通路可能作为模型的主要特点是在肠道给其他途径产生丰富的代谢产物 (见补充讨论和扩展数据图8)。
扩展数据图8 7α-去羟基化途径的代谢逻辑学 作为厌氧电子受体的高度氧化的代谢中间体。在7α无羟基化过程的前半段，连续两次双电子氧化使7-羟基连续脱水，生成高度氧化的中间体3-oxo-4,5-6,7-二氢- DCA。在该途径的后半段，连续三次二电子还原将该分子还原为DCA，导致净二电子还原。前两种减少是由Fe-S黄素酶完成的，它包含一套四个辅助因子，使它们能够将双电子输入转换为单电子复写。扩展数据图1显示了先前提出的通路。
扩展数据图1 先前提出的在C. scindens VPI12708中胆酸7α-去羟基化的途径 详见正文和以往文献综述。CA,胆酸。
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