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编译：YQ，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 传统植物病理学基于单一病原-宿主进行研究，防治措施也基于单一致病菌甚至单一基因型。然而现代植物病理学强调病原的种群多样性以及制定防治措施时精确靶向病原多样性。在田间，植物病害的爆发可能是聚集分布的混合菌株（集合种群）引起。使用病原特异性分子标记对环境样品进行分析是研究病原种群重要方法，研究表明有性繁殖的微生物存在许多基因型混合侵染的现象，而无性繁殖的细菌则没有具体研究。影响病原菌的寄主适应性的其中之一是共现的微生物，有时植物病害与多种微生物相关，这些微生物跨越多个分类学界限，对致病机制产生不同影响。而且这些共现的病原菌种群的协同作用影响其毒力和传播。因此，需要对植物微生物组进行定量研究，以确定影响病害的微生物之间的相互关系。 鸟枪法宏基因组学是研究环境微生物群落的重要方法，目前的计算工具能够通过宏基因组序列对人类/动物致病菌进行流行病学评估以及菌株水平诊断。从宏基因组中获取特定菌株的基因需要借助基因组数据库或特异标记基因进行组装，或者对比对至参考基因组的序列单核苷酸变异模式进行分析，这种方法可以区分99%平均核苷酸相似性的菌株，提供样本中多种病原基因型的种群动态。 本研究利用宏基因组方法对感病的番茄和辣椒微生物群落分析，这些植株表现由黄单胞杆菌（Xanthomonasspp.）引起的细菌性叶斑病的典型症状。细菌性叶斑病是番茄/辣椒的重要病害，据报道由四种黄单胞杆菌引起（X.perforans、X. euvesicatoria、X. cynarae pv.gardneri、X.vesicatoria），其中X.perforans主要侵害番茄，X.euvesicatoria主要侵害辣椒，种子是病原传播的主要途径，多种种植材料可能导致多种病原基因型侵染的空间聚集模式。本研究目的在于分析多种致病菌在细菌性叶斑病爆发的田间的共现模式，及其共存频率，以及是否存在多个基因型同时侵染（种内异质性），为病原菌集合种群的潜在致病性提供线索。 论文ID 原名：Genome-resolved metagenomics to study co-occurrence patterns and intraspecific heterogeneity among plant pathogen metapopulations 译名：宏基因组研究植物病原菌间的共现模式和种内异质性 期刊：Environmental Microbiology IF：4.933 发表时间：2020.07 通信作者：Neha Potnis 通信作者单位：奥本大学昆虫和植物病理学系 实验设计 结果 1、宏基因组揭示多种细菌属/种的共现模式 本研究从美国阿拉巴马州的番茄和辣椒田获得细菌性叶斑病相关的细菌群落及其宏基因组序列。从叶片样品洗涤液中提取的微生物DNA获得7.98~18.00Gbp的基因序列数据（表1）。宿主基因对样品的污染较小（~8%），每个样本序列过滤后保留69~87%，具一定可靠性（图1A）。拟合稀释曲线表明9/13的细菌群落的宏基因组获得>95%的微生物丰度（图1B），且不同细菌群落出现丰度多样性（图1C）。 分析细菌群落的分类学时（图2A），除了健康对照（Pep_Macon_18a），所有样品的分类单元大部分为X. euvesicatoria和X. perforans。Pseudomonas cichorii（一种番茄叶斑病病原）在除Tom_Dekalb_18a样品外，其余样品均存在，相对丰度5-30%。3个番茄田样品发现X. arboricola，相对丰度2-11%。分析微生物种群的共现网络时，选择10个黄单胞菌属群落占<90%的样品（图2B）。共现网络中包括37个节点和82个边界。分析表明菊欧文氏菌属与P. putida（植物细菌性软腐病病原）之间存在共现，而这些类群仅存在于E.V. Smith农场采集的无症状的辣椒和番茄田，推测这属于当地特异的种群。植物内生细菌也存在共现状态，包括P. syringae、P. oryzihabitans、Aureimonas ureilytica，以及鞘脂单胞菌属和甲基杆菌属，这些种类在先前大豆、拟南芥、三叶草的宏基因组中报道，表明这些细菌在植物表面广泛存在。 在症状明显的叶片中，有几种分类单元的丰度显著增高，包括Stenotrophomonas maltophilia、P. fulva、Defltia acidovorans、P. fluorescens。S. maltophilia对许多植物病原真菌和细菌表现抗菌活性，因此在共现网络中与黄单胞杆菌属负相关，然而它也是番茄上一种新兴疾病的病原，增加了混合侵染的可能性。后续研究需要更广泛的采样工作，以确定番茄辣椒病原菌相关的细菌的生态意义。综上，宏基因组揭示了环境微生物丰度，深入解释病原菌的高精度种群动态。 表1 本研究的样品来源、DNA质量、宏基因组数据 图1 宏基因组数据质量过滤和覆盖度。A：堆叠条形图，汇总每个样品的低质量reads（红色）、植物寄主reads（黄色）、高质量微生物reads（绿色）；B：稀释曲线，样本的测序深度与覆盖率用圆点表示；C：相对丰度>0.1%的分类单元与序列多样性指数（Nd）的关系。 图2 番茄/辣椒细菌群落的分类学概况。A：分类单元的相对丰度，Tom表番茄田，Pep表辣椒田，数字表示采集年份17-201718-2018；B：分类单元的共现网络，线条宽度表相关程度，蓝色表正相关，红色表负相关，节点大小表相对丰度。 2、杂草的致病菌多样性 本研究采集了采样田周围的杂草，杂草的微生物DNA回收率较低，需重复提取10次才能获得足够的模板进行测序。虽然杂草宏基因组测序深度与番茄/辣椒相似，但从提取的DNA中只提取了49%的估计序列丰度，表明其微生物复杂程度显著提高。杂草宏基因组中共发现50个分类单元，与同地点的番茄/辣椒叶片宏基因组的分类单元有许多常见腐生菌重叠的情况，比如假单胞菌属、鞘脂单胞菌属、甲基杆菌属、代尔夫特菌属、寡养单胞菌属等（图3）。尽管杂草具有丰富的微生物复杂性，但优势菌种Pantoea ananatis占接近一半丰度，因此能够构建P. ananatis完整基因组，显示99.19%的核苷酸相似性和90.04%的基因组覆盖率（表2）。先前研究表明杂草是P. ananatis的重要流行来源，同时也是植物叶面微生物，后续研究对其进行分离培养有助于补充宏基因组推断。X. euvesicatoria在所有样品中共有，尽管杂草中的相对丰度较低（~1.5%）。将杂草中的微生物reads与X. perforans LH3进行比对，表现99.82%的相似性，证明杂草中存在X. perforans，但丰度较低，表明杂草可能是病原菌的传播介质但不是来源。 表2 番茄、辣椒、杂草的黄单胞杆菌数据集 图3 杂草的微生物种群共现模式。节点着色根据系统发育分析，绿色为共有微生物，蓝色为杂草和番茄共有，橙色为杂草和辣椒共有，灰色为特异菌株。 3、宏基因组揭示黄单胞杆菌多种基因型的共现 根据上述的系统发育标记无法区分X. euvesicatoria的各种基因型，因此需要基于黄单胞杆菌基因组进行种群区分。根据宏基因组可以获得~87%覆盖度的黄单胞杆菌基因组。由于高覆盖度和高测序深度，支持从头拼接，组装长度>4.65Mbp（表3）。核心基因（2667个同源基因）的系统发育分析结合参考基因组显示辣椒样品的种群聚集在X.euvesicatoria，而番茄内的种群聚集在X.perforans（图4A）。先前研究显示美国佛罗里达州和阿拉巴马州的6个不同序列集群（SC），番茄内的种群聚集于SC3、SC5、SC6，本研究的一个番茄样品（Tom_Baldwin_17a）在SC6与SC2分支的中间，集群间的中位距离分别为444和684个SNP。由于从头拼接的自然补齐，推测这种不寻常的分支可能是多个X. euvesicatoria基因型共存导致的嵌合体。 为进一步分析宏基因组中多基因型的发生情况，首先利用StrainEst算法对样本进行单核苷酸变异分析（图4B），结果显示塔斯卡卢萨的一个辣椒样品发现X. euvesicatoria和X. perforans的共现，而与Lee County的样品的种群有强烈的不同，推测细菌性斑点病相关病原可能发生遗传交换的生态位。然后对X. perforans进行第二轮单核苷酸变异分析，结果显示SC3、SC5、SC6是优势菌株，且存在不同程度的共现（图4B），有4个番茄样品被单一基因型（SC3或SC5）侵染，相对丰度<20%，而有2个样品中SC3和SC5共现，这种从单基因型到多基因型的转变可能是由于种植者使用多个来源的种子种植/移植的后果。 农业田间X.perforans种群多样性的调查的重要性不仅是评估病原的生态位，更重要的是确定病原适应性下的特定毒力因子。本研究描述宏基因组中黄单胞杆菌的效应蛋白家族，并对比它们的相对丰度（图5）。分析表明质粒编码的效应蛋白在不同菌株间丰度差异巨大。XopJ2和AvrBs3（转录激活效应蛋白）是黄单胞杆菌重要的毒力因子。X. perforans可聚类为2组，基于XopJ2/XopJ6的存在/缺失。这些效应蛋白序列的相对丰度与基因型相关，其中XopJ2和SC3相关，AvrBs3与SC5相关，PthXp1常见于SC4和SC5菌株，AvrHah1在SC6中常见。因此，通过宏基因组序列中的效应因子可以评估病原菌群体的整体致病潜力和低丰度的功能潜力。这些发现对抗性育种策略有重要意义，因为抗性育种策略必须基于特定病原体效应因子，且本研究宏基因组数据表明X. perforans可通过多种基因型导致的不同感染策略在田间迅速克服选择压力。 表3 X. perforans和X. euvesicatoria的基因组获取。 图4 X. perforans和X. euvesicatoria的种群动态。A：基于2667个同源基因的系统发育树，红色样品为本研究基因序列；B：序列集群（SC）的相对丰度。 图5 X. perforans和X. euvesicatoria的3型分泌系统效应蛋白的相对丰度。A：效应蛋白相对丰度聚类；B：序列集群的相对丰度；C：效应蛋白序列的相对丰度，红色为质粒编码效应基因。
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