【原】宏基因组分析自然生境下细菌-噬菌体长期共存动力学

LorMe青年 2021-07-28

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作者：侯如娇，南京农业大学硕士在读，主要研究利用噬菌体防治土传病害。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍细菌和噬菌体长期共存动力学，原文于2020年发表在《The ISME Journal》上。

导读

噬菌体是一种侵染细菌的病毒，在与细菌宿主互作的过程中可影响生态系统的功能。目前，室内实验对噬菌体-细菌的研究促进了对其表型和遗传多样性的理解。然而，在复杂的自然环境中，噬菌体-细菌长期共存时会发生什么样的变化？相互作用的动力学如何？本文使用从大型污水处理厂收集的三年数据样本，对Gordonia与其噬菌体之间的互作动力学进行宏基因组分析，监测了随时间的推移，Gordonia基因组中CRISPR位点的改变以及病毒基因组的变化，进而全面了解自然进化种群中噬菌体-Gordonia共进化动力学。细菌宿主和噬菌体的宏基因组重建揭示了种群水平的复杂性如何影响细菌-噬菌体共存。

一、Gordonia基因组中CRISPR基因座分析

Gordonia基因组中包含2个CRISPR Cas基因座。试验基于原始读取的整个宏基因组数据的间隔区，进行所有可能连接的重叠，重建所有观察到的CRISPR-1阵列（图1）。结果发现在CRISPR-1基因座尾部的方向上，间隔子高度保守，而新间隔子的获得导致CRISPR群体显著增加。CRISPR-1的间隔区排列显示有一个特殊的间隔区作为转折点，之后CRISPR变异的多样性在先导端方向上显著增加。前端的低覆盖率扇形结构证实了新的间隔物的有效结合。这些新获得的间隔区大部分与共存噬菌体（DC-56）的序列完全匹配，少数间隔区与噬菌体DS-92基因组的序列相匹配，特别是在短支链中，表明可该菌株能够同时适应多个噬菌体。

图1 重建Gordonia的CRISPR-1间隔区排列

二、噬菌体-细菌共存时CRISPR-1突变体丰度动态

过滤低覆盖节点后，在断点节点上游识别出11个CRISPR-1的主要突变体（图2A），这些主要分支中大部分间隔区与共存噬菌体DC-56相匹配，主要突变体随时间的丰度分布如图2B所示，其中CRISPR-1突变体的前导序列（L1）紧靠一致性区域上游，占大多数样本总丰度的一半以上（图2C）。在所研究时间间隔内的丰度曲线表明噬菌体丰度是通过裂解而不是溶原维持的。在每个时间点，细菌和噬菌体基因组丰度发生相同的相对变化，而微生物生物量在整个研究时间尺度上保持相对稳定。噬菌体DC-56的峰值与缺乏抗病毒间隔区的易感Gordonia宏基因组丰度较高的时间点相吻合。因此，细菌与噬菌体共存需要一种避免或抵抗感染的策略，但噬菌体的复制和存活也是由易感细菌种群所允许的。从长远来看，自然环境下宿主和病毒能长期共存，不会因为细菌CRISPR调控抗性的间隔区多样性导致噬菌体迅速灭绝。

图2 随时间推移CRISPR-1突变体的丰富性

三、噬菌体DC-56的适应性探究

为了分析噬菌体对CRISPR-1多样化的反应，重点研究了噬菌体DC-56基因组的序列，其丰度反映了Gordonia的宏基因组。285个靶向噬菌体DC-56基因组的间隔区分布在整个噬菌体基因组中（图3）。然而，根据现有的数据，不能排除低原间隔区密度区域受到Gordonia识别不同Chi序列的保护，或者受到干扰驱动或启动间隔区获取等其他过程的参与。

图3 噬菌体DC-56基因组图谱中原间隔区的位置

通过病毒SNV分析，研究了3年来DC-56噬菌体基因组的变化。每个核苷酸位置与该位置一致核苷酸的错配覆盖最小为5时，被标记为SNV（单核苷酸变异），共有610个SNV符合这一标准。为了检验突变体选择效果的差异，检测了原间隔区和噬菌体基因组其他地方的非同义和同义多态性的比率，发现该比率没有显著差异。其中82个SNV位于54个原间隔区和5个PAM区（4A，B）。Fisher检验显示SNV在原间隔区的出现频率并不比在基因组的其他部分高。大多数间隔物出现在数量有限的样品中，覆盖率很低。尽管如此，可以观察到SNV模式随时间的变化似乎并不是由靶向相应序列的间隔区的存在所决定的（4C），SNV模式可能是CRISPR等位基因免疫选择的结果。

图4 噬菌体DC-56SNVs的发生和随着时间推移匹配间隔区的丰度

利用系统发育信号研究噬菌体DC-56的纵向种群动态。试验基于噬菌体DC-56基因组中出现的SNV，分析了每个样本中DC-56序列与时间的关系。结果发现样本在很大程度上是根据时间点进行聚类的，噬菌体DC-56群体基因组随时间发生方向性变化（图5）。

图5 重组噬菌体DC-56的系统发育信号分析

结论

这项研究提供了一个复杂的自然环境中（如来自大型污水工厂的活性污泥）细菌及其两个噬菌体的高时间分辨率剖面图。宏基因组分析表明，菌株Gordonia基因组中CRISPR基因座的尾部具有保守克隆性，噬菌体基因组通过引入方向性改变而共同进化。宿主-病毒长期共存是通过一个几乎克隆的Gordonia种群的CRISPR位点多样化和噬菌体基因组的方向性变化建立的，多样性较大的CRISPR基因座可为整个种群提供更具弹性的免疫力。大量易感细胞的持续存在有利于维持与噬菌体的稳定共存。下一步可结合宏基因组时间序列研究，进一步了解土壤中细菌-噬菌体动力学和相互作用，为利用噬菌体防控土传病害，长期维持土壤健康提供理论依据。