【原】科研 | Nature 子刊：口服噬菌体原位调控肠道内特定细菌的基因表达

微生态 2021-04-13

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编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

近年来，肠道微生物与人体健康之间的密切联系表明，通过改造修饰特定肠道细菌功能可以作为一种有效的治疗策略。然而，由于肠道内部的复杂的生理结构，其中牵涉到肠道细菌和宿主、菌群内部微生物之间以及肠道微环境之间的相互作用关系等等，想要在不破坏肠道微生态系统和宿主生理环境的情况下原位操作肠道细菌特定基因是十分困难的。

在本研究中，研究者基于多学科交叉，通过口服递送系统来调节肠道内特定细菌的基因表达。该研究开发了一种表达可编辑dCas9的温和λ噬菌体在哺乳动物肠道中靶向抑制大肠杆菌基因。此外，为了便于噬菌体给药，同时最大限度地减少对宿主微环境的干扰，该研究还开发了一种基于肠道微生物释放机制的胶囊制剂，使其有助于体内口服噬菌体的释放。该研究将这些技术结合起来，证明了在哺乳动物肠道中可以通过单次口服进行精确的原位修饰特定细菌的基因表达。

论文ID

原名：In situ reprogramming of gut bacteria by oral delivery

译名：通过口服递送系统进行原位基因编辑调节肠道内特定细菌的基因表达

期刊：Nature Communications

IF：12.121

时间：2020.6

通讯作者：Bryan B. Hsu

通讯作者单位：弗吉尼亚理工生物科学系、哈佛医学院系统生物学系

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实验设计

本研究通过改造λ温和噬菌体，使其表达dCas9、trcrRNA和crRNA，分别构建了λ::dCas9和λ::dCas9^rfp噬菌体，从而抑制肠道内大肠杆菌的特定基因，通过检测红色荧光蛋白的相对荧光强度，对噬菌体靶向基因修饰功能进行检测。为了阻止口服递送过程中噬菌体遭到破坏而失去活性功能，该研究通过层层包被技术，使用钙介导的海藻酸钠溶液交联作用来制备包被有(聚乙烯亚胺/果胶)_15.5薄膜的海藻酸盐微球包封的噬菌体，并对其体内活性进行了检测。

图1 实验设计思路。

结果

1 含有dCas9的工程化噬菌体体外抑制靶基因

如图2a所示，我们的工程结构通过替换部分非必需的b2区域插入到λ基因组中。我们在含有rfp和gfp基因的大肠杆菌中测试了上述系统，发现基于质粒的金黄色葡萄球菌的dCas9能有效抑制荧光蛋白的表达（附图1）。将含有靶向rfp（λ::dCas9^rfp）的crRNA噬菌体加入大肠杆菌培养液中，结果发现rfp的荧光强度明显低于不含该crRNA的噬菌体(λ::dCas9)(图2b)。与接受噬菌体的样品相比，接受缓冲液的大肠杆菌的荧光强度在2-6小时呈短暂的下降趋势，这是由于λ::dCas9和λ::dCas9^rfp噬菌体处理的样品中缺乏最初的噬菌体繁殖(图2 c)。此外，与λ::dCas9噬菌体相比，λ::dCas9^rfp中crRNA的存在并不显著影响细菌的生长。为了进一步证实基因抑制在细菌溶源体形成之后仍能维持，该研究测量了大肠杆菌溶原体的RFP荧光强度，并证实了与非溶原体和λ::dCas9溶原体相比，λ::dCas9^rfp溶原体中RFP荧光发生显著减弱(图2d)。溶源性不影响细菌早期的指数生长，但可能影响后面平台期的细菌密度(图2e)。

图2 通过l::dCas9^rfp进行体外基因抑制。l噬菌体抑制基因的体外实验示意图(a)。在大肠杆菌培养基中加入噬菌体缓冲液，对l::dCas9 噬菌体, or l::dCas9^rfp噬菌体进行RFP荧光(b)和细菌密度(c)跟踪。非溶原性、l::dCas9溶原性和l::dCas9^rfp溶原性大肠杆菌培养物的RFP荧光(d)和细菌密度(e)。

附图1 基于质粒的体外基因抑制。大肠杆菌中在crRNA靶向rfp 的条件下，atc诱导dCas9表达(A)。25 ng atc诱导后的相对荧光(B)和6h孵育后atc浓度的变化(C)。符号代表独立的实验(-crRNA, 0 ng=2, 50 ng = 4; +crRNA, 0 ng = 2, 100 ng = 5; 其他样本为6), 直线表示均值。

2 工程噬菌体在原位修饰肠道细菌基因。

研究者对工程化的噬菌体在体内的有效性进行了测试，通过对预先定植表达RFP的大肠杆菌的小鼠口服λ::dCas9，λ::dCas9^rfp或对照培养基（噬菌体缓冲液），然后对小鼠粪便中噬菌体和大肠杆菌的浓度进行追踪检测(图3a)。为了减少灌胃过程中在胃肠道的降解，在口服干预之前，噬菌体溶液被稀释10倍至碳酸氢钠溶液中以中和胃酸。如图3b所示，给药后不久便可以在粪便中检测到高浓度的噬菌体。尽管在肠道中引入了噬菌体，检测小鼠粪便中大肠杆菌的总浓度基本保持一致(图3c)，这表明中等剂量(1´10⁷ pfu)的温和λ噬菌体对大肠杆菌的浓度没有显著影响肠道中的同源细菌。此外，该研究发现，在噬菌体给药后不久，粪便中有相当一部分大肠杆菌是λ::dCas9或λ::dCas9^rfp溶原性细菌，并在实验过程中一直持续 (图3 d)。

此外，该研究通过测量从口服噬菌体给药后的小鼠粪便中分离出的λ::dCas9和λ::dCas9^rfp溶原体的RFP的相对荧光强度，来评估工程噬菌体的对功能基因的抑制作用。如图3e的代表性细菌培养皿所示，与接受λ::dCas9噬菌体处理的小鼠相比，λ::dCas9^rfp噬菌体处理的小鼠粪便中大肠杆菌菌落具有稳定的GFP荧光和显著降低的RFP荧光。上述结果与体外培养λ::dCas9和λ::dCas9^rfp溶原体相似。对每只实验小鼠在每个时间点的约50个粪便菌落克隆的相对荧光进行整体观察，结果显示，随着时间的推移，RFP的荧光抑制在每只小鼠体内得到了较好的维持(附图2)。其中，相比较而言，λ::dCas9^rfp噬菌体处理小鼠较λ::dCas9噬菌体处理的小鼠出现了比较明显的RFP荧光减弱(图3f)。

图3 噬菌体在体内递送实现基因抑制。将预先定殖表达RFP和GFP (a)大肠杆菌的小鼠口服含工程化噬菌体的碳酸氢盐溶液。口服后,粪便中噬菌体(b),总大肠杆菌(c),和裂解的大肠杆菌百分比(d)。粪便中溶原体菌落的典型荧光图像与对照相比较，在5只小鼠中，每只小鼠在3个时间点上均可重现(e)。小鼠粪便溶原性细菌的相对荧光强度按GFP强度标准化。阳性对照和阴性对照分别代表体外培养l::dCas9^rfp和l::dCas9^rfp溶原体(f)。

附图2 粪便样本中大肠杆菌相对菌落荧光强度。分别接受λ::dCas9噬菌体(n=5) 和λ::dCas9^rfp噬菌体(n=5) 小鼠粪便中的50个菌落克隆。对照组为体外培养后的溶原体。直线代表中位数。

3 薄膜涂层抵抗胃酸

为了使噬菌体在没有缓冲剂中和的情况下在口服时能保持足够活性不被降解，研究者开发了一种能抵抗酸渗透的水性包封策略。将海藻酸溶液滴加到搅拌的氯化钙溶液中生成海藻酸微球，氯化钙溶液通过离子交联介导凝胶化。果胶与细菌降解有关，一旦到达肠道，就会触发微球降解。该研究证实，用于确保噬菌体和海藻酸微球稳定性的氯化钙并没有破坏聚电解质络合，而且这些薄膜在含有胃蛋白酶的模拟胃液中仍然可以保持完整。LBL薄膜包被的海藻酸微球能抵抗外界pH值的变化。我们通过封装Oregon Green 488 -右旋糖酐共聚物来检测这些薄膜的耐酸性，该共聚物中含有pH敏感染料，在中性pH下具有荧光，而在酸性条件下则发生荧光淬灭。当悬浮在pH为1.1的模拟胃液中，这些微球的荧光猝灭表明微球内部从pH为7.5的初始生理条件开始逐渐酸化(图4a)。如图4b所示，在30秒内，酸性液体很容易渗透进入未包封的海藻酸微球(0-BL)。逐渐增加双膜层的数量，即外层薄膜的厚度，可以显著提高微球的耐酸性。相对荧光强度的定量显示，增加双膜层的数量至15到15.5-BL涂层，可以显著增加微球的耐酸性，涂层的内部条件在最初90秒内可以几乎保持不变(图4c)。

图4 海藻酸钙微球的耐酸性。将pH敏感染料包封在微球中可以测量微球在模拟胃液中孵育后的pH值，构建的弱、中、强耐酸的荧光指示微球出现有大或小的损失(a)。通过代表性微球的荧光示踪，无涂覆(0-BL)和涂覆(15.5-BL)海藻酸钙微球在耐酸性方面表现出明显的差异(b)。在pH 1.1的模拟胃液中孵育90s后的微球的荧光变化，荧光的变化与微球上沉积的膜的数量有关(c)。

4 包封在口服过程中保护噬菌体

LbL薄膜包被微球在小鼠口服过程中可以较好的保护噬菌体不被破坏。为了确定上述包封策略在口服给药期间的保护作用，研究者给小鼠口服灌胃不同配方的低剂量(1´10³pfu)的噬菌体(图5a)。如图5 b所示, 将包被有(PEI/pectin)_15.5薄膜的海藻酸微球包封的噬菌体口服给药，2天内所有小鼠粪便中均可以检测到噬菌体，并持续2周时间。相比之下，噬菌体单独，或与涂有(PEI/pectin)_15.5薄膜的海藻酸空壳共同口服给药，均未发现小鼠粪便中有存活(图5b)。后者表明上述包封过程是必要的，而包被微球空壳并不能通过某种方式使消化过程失活来提供保护作用。同样地，表面未包覆LbL薄膜的藻酸盐微球包裹的噬菌体也可以被完全灭活，证实了LbL薄膜包被也是必不可少的保护成分。

图5 口服胶囊制剂对小鼠噬菌体存活的影响。经大肠杆菌预定殖的小鼠口服噬菌体制剂(a)。小鼠分别给予游离噬菌体(n=5)、包裹在包被微球中的噬菌体(n=6)、游离噬菌体与空的逐层LBL包被微球的混合物(n=3)、包裹在LbL包覆微球中的噬菌体(n=6)。LBL包被是指(聚乙烯亚胺/果胶)_15.5薄膜的涂层。粪便中溶原体和噬菌体随着时间的浓度量化分析(b)。

5 细菌原位修饰并不破坏胃肠屏障

封装的噬菌体可以在原位改变肠道细菌而不损害胃肠功能屏障。前面的研究证实噬菌体在水中游离，在口服给药时很容易失活，只能提前进行胃酸中和，或以非常高的浓度灌胃，除非将噬菌体包被在微球中。为了确定包封过程是否会损害l::dCas9^rfp噬菌体的功能，研究者将该噬菌体以低浓度(5×10³pfu)置于悬浮在水中的层层包被的微球中，或作为游离噬菌体与碳酸氢盐缓冲液混合以中和胃酸(图6a)。小鼠经口服噬菌体给药后，通过粪便检测发现粪便中噬菌体浓度 (图6b)，大肠杆菌浓度(图6c)，粪便大肠杆菌的溶原性转化(图6d)、粪便噬菌体与大肠杆菌的比例的情况相似（附图3）。检查l::dCas9^rfp单克隆的相对RFP荧光，结果发现，缓冲和封装的噬菌体也具有相似的RFP抑制水平(图6e)。

图6 包封微球可保护口服噬菌体而不损害其功能。游离的l::dCas9^rfp在碳酸氢盐缓冲液中(以确保生存)或包封之后在水中口服给预先定殖表达RFP和GFP大肠杆菌的小鼠(a)。口服后,粪便中噬菌体(b),总大肠杆菌(c),噬菌体溶解的大肠杆菌百分比量化(d)。血清中溶原体相对荧光强度(e)。

附图3 噬菌体与细菌的比例。每只小鼠粪便样本中噬菌体相对于细菌的浓度。符号代表小鼠个体(n = 5)，线条代表几何平均数。

结论

本研究开发了一种非侵入性的治疗策略，通过口服递送方式来精确改造小鼠肠道内特定细菌的基因表达。首先，研究者通过改造温和λ噬菌体来表达nuclease-deactivated Cas9 (dCas9)，使其无论是在体外还是在小鼠肠道定殖时，均能特异性地抑制细菌中的基因表达。其次，为了提高λ噬菌体在胃酸和蛋白酶作用下的存活率，使其能够进入下消化道，并降低其对宿主的生理功能和微生物群落的扰动，研究者开发了一种基于水合微球的包封办法，采用逐层组装方法在口服递送过程中产生一层保护噬菌体的聚合物薄膜。这种生物材料结构包含一个可调谐的微生物特异性的释放机制，在进入肠道细菌密集的大肠时可以触发噬菌体释放。最后，该研究还证明了上述两种技术的结合可以实现对哺乳动物肠道内细菌非侵入性的原位修饰并最大限度的降低对肠道正常生理功能及菌群结构的破坏。

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