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编译：小贤哥，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读
肠道菌群可以影响哺乳动物免疫系统的发育和稳态，同时也和人类炎症，免疫相关疾病和免疫疗法的应答息息相关。但是对于肠道菌群如何调控免疫系统仍然知之甚少，尤其是人类免疫系统，因为目前很难直接进行基于人体实验的验证。 本研究中，研究者密切观测了数百名住院的癌症患者，这些患者在接受化疗和干细胞移植术恢复后进行了造血细胞移植。这些治疗措施造成了循环系统免疫细胞和微生物巨大的变化，但同时也为探究这两者之间的关系提供了契机。 研究者通过分析观察到的循环中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞每日计数变化，以及基于超过10000个微生物纵向队列样品，揭示了肠道菌群和免疫细胞动态之间的一致关联。研究者用高精度的临床表征数据和贝叶斯推断，通过比较细菌属和免疫调节药物的影响，揭示了肠道微生物群对系统免疫细胞动力学的重大影响。这项研究建立并量化了肠道菌群和人体免疫细胞的关联性，揭示了在微生物驱动下的免疫调控。 原名：The gut microbiota is associated with immune cell dynamics in humans通讯作者：Jonas Schluter &Joao B. Xavier
通讯作者单位：
纽约大学朗格尼医学中心&美国斯隆·凯特琳纪念癌症中心Web results那不勒斯腓特烈二世大学本研究主要纳入了两个独立的大规模造血细胞移植队列，包括美国斯隆·凯特琳纪念癌症中心（Memorial Sloan Kettering CancerCenter，病例总计2926例（2003年至2009年））和美国杜克大学（Duke University，病例总计493例）。根据所研究的科学问题，实验设计和相关数据处理如下： 1）为探究造血细胞移植（HCT）后，病人的免疫系统重建和肠道菌群动态情况，研究者对造血细胞移植前后2335例病人进行了长达100多天的每日数据收集，包括HCT之前（放疗阶段），术后中性粒细胞减少症阶段和免疫重建阶段的三个重要阶段。病人的血液样本在临床血液学实验室采集并通过Sysmex XN自动化血液分析仪进行分析，对所有血液白细胞定量计数，主要包括中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞。依据移植物来源将病人分类观察，包括外周血干细胞移植（PBSC），脐带血移植(cord)，CD34+选择移植（TCD）以及骨髓移植（BM）病人。同时，对粪便样本进行16S rRNA测序和相关生信分析（DADA2），获得肠道菌群组成的信息。 2）为探究肠道菌群和循环白细胞变化的因果关系，研究者纳入了24名中性粒细胞移植后病人的921例血液样本，包括了随机试验中14名自体粪便微生物群移植（auto-FMT）的病人，以及10名没有进行auto-FMT的对照。通过线性混合效应模型（linear mixed-effectmodel）用是否接受auto-FMT对白细胞周均值进行回归分析，得到auto-FMT对白细胞计数的影响。 3）为探究肠道微生物的组成和白细胞恢复的动力学的关联性，研究者设计了双阶段分析方法。 阶段一，选取来自1096个病人的20751对配对的移植后血液样本（不含微生物数据），计算其处于恢复过程的中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的一天内变化。利用交叉验证的特征选择（cross-validated feature-selection）方法选出了和白细胞动力学相关联的用药和HCT的指标参数。 阶段二，纳入841个病人的2615个微生物样本，将微生物数据作为预测物放入到贝叶斯推断（Bayesianinference）模型中，来以此评估微生物的相对丰度以及总丰度，和白细胞动力学的相关性。研究者以PBSC病人作为发现队列，在TCD，cord和BM病人中计算了验证指标（v-score）。此外，研究者也纳入了杜克大学的数据作为额外的独立验证。 4）为了探究免疫系统对微生物的影响，研究者采用了和阶段一类似的方法。研究者从481个病人的3995份粪便样本中测量每克粪便细菌总16S rRNA基因拷贝数，以此计算得到绝对的细菌计数。从而建立细菌和外周血免疫系统动力学的双向关联互作网络。通过采用放宽正则化强度（relaxing the regularization strength）方法揭示了白细胞和肠道菌群动力学的双向作用。同时，研究者也对124个样本额外采用了宏基因组测序（shotgun metagenomicssequencing），由此得到在高效微生物重建的样本中，所富集的微生物通路功能。5）研究者最后利用后验系数分布模拟了白细胞动力学，探究了费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)丰度和免疫系统重建所需时间的关系。 
实验设计和样本选择图
1 造血细胞移植（HCT）之后的免疫系统重建和菌群动态 放疗的辐射摧毁了白细胞，从而导致中性粒细胞减少症（neutropenia）（每微升血液小于500个中性粒细胞）。移植的干细胞从骨髓中释放粒细胞，从而重新构建免疫系统（图1a-c）。HCT也损害了原有肠道菌群，致使其多样性减少（图1d-i）。免疫和菌群的重建在不同病人和不同治疗方式间都有很大的不同（图1），因此可以对免疫系统和菌群进行关联分析，以及与免疫调控因子例如粒细胞集落刺激因子(GCSF)相比较。 
图1 造血细胞移植（HCT）之后的免疫系统重建和菌群动态。（a-c），HCT主要阶段：HCT之前day0放疗中免疫消融(I) HCT之后中性粒细胞减少症 (II) 重建 (III)。2003～2019年接受移植病人的中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的日均数量（阴影区表示标准差）（a）比较于（b, c）代表不同干细胞移植来源的恢复中的个体。病人1接受了外周血造血干细胞移植（PBSC），病人2接受了脐带血移植（cord）。带圈状线型展示了来自病人的数据；实线和阴影区表示同一来源所有病人的平均值+/-标准差。在图a中，左侧的彩色柱形图表示健康人中的细胞数量范围。d-f，HCT中微生物多样性的丢失（来自粪便样本的16S测序）。d， 线图表示了病人的日均值，阴影区域表示标准差。e, f, 表示单个病人的数据。g-i，共生菌科的相对丰度。g, 所有病人相对丰度的均值+/-标准差。h, i, 单个病人的相对丰度。
为了探究肠道菌群和血液循环白细胞变化的因果关系，研究者首先利用了来自自体粪便微生物群移植（auto-FMT）（直接对患者进行的受控微生物实验）的随机实验数据。为探究auto-FMT是否影响了白细胞重建，研究者比较了24个中性粒细胞植入之后（定义为在连续的3天观察到超过每微升500个中性粒细胞）个体的中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞数量。auto-FMT在中性粒细胞移植后不同日期进行（图2a）。总之，研究者在中性粒细胞移植后100天内的auto-FMT个体中观察到了更多数目的每种白细胞类型（P <0.001，图2b, c）。
图2 中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞在auto-FMT个体的接下来几周治疗中实现了增长。a, 中性粒细胞植入后，10例对照和14例auto-FMT病人的中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的绝对数量。竖线表示随机的auto-FMT日期。b, auto-FMT后细胞数量的周均值。折线表示周均值，阴影区域表示95%置信区间。c, 用线性混合效应模型将时间对中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞进行回归，回归系数显示了每种白细胞都在auto-FMT后实现了增长(βFMT: P = 4 × 10−11 (中性粒细胞),P =2 × 10−10 (淋巴细胞) andP = 2 × 10−16 (单核细胞)。在b, c中, N =24个个体，n=921个血液样本。
为了探究微生物和白细胞恢复的动力学之间的关系，研究者转向了接受HCT的大规模观察队列。血液循环中白细胞数量的稳态是一个复杂，且变化的过程：白细胞的形成以及释放进入血液，是通过不同的骨髓造血细胞前体的分化，这一过程可通过胸腺和淋巴结（淋巴细胞）以及脾脏，肝脏和肺脏（中性粒细胞）中的动员实现；白细胞也可以从血液向其它需要的组织迁移。为了发现这个动态过程的调控因子，研究者应用了双阶段方法来分析两天之内的白细胞数量变化（图3a）。第一阶段利用来自1096个病人的血液和用药数据（不含微生物数据）来进行临床和元数据的特征选择。第二个阶段利用来自另一个含841个不同病人独立群体的数据（含微生物数据），来分析微生物和外周血液免疫细胞的动态学关联。在第一阶段，研究者分别利用了超过20000对配对的移植后病人血液样本，分析了处于恢复过程的中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的一天内变化（图3）。利用交叉验证的特征选择方法选出了和白细胞动力学相关的用药和HCT的指标参数（图3a-c）。在第二阶段，研究者计划进一步研究肠道微生物对此的贡献。他们利用不同数据集的病人微生物数据进行贝叶斯推断。阶段一的发现符合预期，即干细胞移植物的来源和免疫的重建动力学相关（比如说，脐带血移植（cord）来源的免疫动力学变化要慢于外周血移植来源（PBSC）），于此，研究者在阶段二将病人依据移植物来源进行了分层。阶段二的动力系统模型也因此不仅包含了从阶段一选择的药物，临床特征（放疗强度，年龄和性别），和基于嗜中性粒细胞，淋巴细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞和血小板计数形式的血液当前状态，还包含了用做预测每天白细胞数量变化的细菌属（图3a）。这个数据集包含了841个个体，但是配对计算白细胞数量每日变化的粪便样本中，将近60%的样本是在HCT前所收集，因此白细胞数量为零。尽管如此，研究者仍然从超多2000多个移植后的样本观察到了白细胞的改变，这个样本量已足够用来分析免疫细胞动力学（图3b）。阶段二重点放在了来自最大队列的数据：外周血干细胞移植（PBSC）病人。研究者保留了其他队列（骨髓（BM）移植队列；CD34 +选择移植物（TCD）造成的T细胞离体耗竭队列；和脐带（cord）移植队列进行验证评分，并纳入了来自杜克大学治疗的患者的数据以进行额外验证。值得一提的是，在所有预测特征中，关联性最强的是粒细胞集落刺激因子(GCSF)。GCSF已知具有加快病人从放疗后的中性粒细胞减少症中康复的功能。本研究观察到了GCSF和两天内中性粒细胞140%的增长率相关((HPDI95)(+114%, +170%))。这个现象在所有MSK癌症中心（v-score =3, 图3d）和杜克大学的群体中得到验证。除此以外，研究者还发现GCSF和单核细胞43%的增长率相关（HPDI95(+30%,+58%),v-score= 3），以及和淋巴细胞16%的增长率相关（HPDI95 (+5%, +27%), v-score= 3）。抗组胺药或免疫抑制药物可导致中性粒细胞和淋巴细胞率降低(西替利嗪, −18%, HPDI95(−35%, +5%);霉酚酸酯,−8%, HPDI95 (−15%, +1%))。最后，强度较低的化疗（非消融和强度降低）与淋巴细胞和单核细胞率增加相关。除了和用药在机制上相关外，研究者也对当前白细胞数量和其变化率做了相关性分析：中性粒细胞和淋巴细胞数量与单核细胞率呈负相关，血小板和淋巴细胞数量与淋巴细胞率以及中性粒细胞率呈负相关（图3e）。相反，研究者观察到单核细胞数量与其它类型的白细胞率呈正相关。研究者观察到了细菌属和白细胞动力学相关的一致性（图3f）。较高丰度的费氏杆菌属(Faecalibacterium, +8%, HPDI95(+1%, +14%))log10变换的每单位差异），瘤胃球菌属(Ruminococcus2, +5%,HPDI95(0%, +10%)log10变换的每单位差异)，和阿克曼菌属(Akkermansia, +4%, HPDI95(+1%,+7%)log10变换的每单位差异)与中性粒细胞率升高相关，而罗斯氏菌属(Rothia, −3%, HPDI95(−7%, 0%)log10变换的每单位差异)和狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto1,−3%, HPDI95(−6%, 0%)log10变换的每单位差异)则和中性粒细胞率降低相关。这些结果在杜克队列的单变量分析中得到了验证。研究者也用细菌总丰度来替换相对丰度作为预测特征；这同时也肯定了费氏杆菌属（Faecalibacterium）与中性粒细胞动力学关联性最强。瘤胃球菌属(Ruminococcus2, +5%,HPDI95(+1%, +9%) log10变换的每单位差异)和葡萄球菌属(Staphylococcus, +4%,HPDI95(+1%, +6%)log10变换的每单位差异)同淋巴细胞率呈正相关。费氏杆菌属(Faecalibacterium)和瘤胃球菌属(Ruminococcus2)也和单核细胞率呈正相关，这个结果也在其它队列得到了验证。狭义梭菌属和单核细胞率降低相关(Clostridium sensu stricto1,−3%, HPDI95(−5%, −1%)log10变换的每单位差异)。研究者认为，这些肠道菌类群和白细胞每日变化相关，支持了他们的观点—在肠道微生物组成的响应下的造血作用和动员作用，能对系统免疫产生影响。在肠道菌群影响血液循环白细胞数量的同时，免疫系统也可以反过来影响菌群的组成，例如，在小鼠实验中证实的免疫球蛋白A通路。为了研究免疫系统如何影响细菌群落，研究者采用和阶段一类似的方法。首先通过细胞数量的绝对改变可以计算得到白细胞的动态变化；其次从一部分样本（481个个体的3995份样本）测量每克粪便细菌总16S rRNA基因拷贝数，得到细菌计数绝对值。从而基于两者建立细菌和外周血免疫系统动力学的双向关联互作网络。通过采用放宽正则化强度方法揭示了白细胞和肠道菌群动力学的双向作用。值得注意的是，研究者观察到了活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)绝对丰度和淋巴细胞率负相关，也验证了基于相对丰度所得出的主要结果（图3f）。在相反方向上，研究者观察到淋巴细胞数量和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)增长率呈正相关。研究者发现有些和白细胞率正相关的细菌是专性厌氧菌，有些可以合成细胞壁分子和短链脂肪酸，这些可以调控免疫反应和粒细胞生成。为了进一步研究，研究者基于每个样本计算了微生物群重建能力。基于124个样本的宏基因组测序显示具有高效力的微生物重建样本富集了胆酸盐降解，维生素B1合成和丁酸酯形成功能通路。该结果表明，宿主可以选择这种广泛可用的微生物性状功能，作为免疫系统和微生物群落之间稳态相互作用的一部分。和白细胞率升高相关的费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)同时也是auto-FMT后重建效果最好的菌属，这也许解释了为什么在auto-FMT病人中观察到较高计数的中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞。该研究发现了费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)，与免疫细胞动力学相关性最强，这也同之前的研究结果（这些菌属与人类免疫调控相关）一致。除此以外，尽管相对于免疫调控药物，肠道菌群起初可能对免疫系统的影响较小，但由于在白细胞变化的影响下，菌群的影响也不可忽视。因此，当这些细菌丰度较高时，影响效应也会增强。为了验证增强效应，研究者利用后验系数分布模拟了白细胞动力学。他们在有GCSF（图3h）或不存在GCSF（图3i）的情况下，选择了费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)（图3g）最高或最低的100个微生物样品，由这些样本模拟构成了1000个时间序列。模拟数据预测，富集这些菌属的菌群会加快免疫重建，在GCSF不存在的情况下到达中性粒细胞数量超过每微升2000个的时间可以缩短2.4天（从预测的6.8（95%置信区间（6.5，7））天减少到4.4天（95%置信区间（4.3，4.5）））。
图3 贝叶斯推断揭示了菌群和循环白细胞数量动力学的关联。a, 模型示意图：连续两天在血液循环中观察到的白细胞数量和当前宿主基于血细胞数量的状态，免疫调节药物，临床元数据以及微生物状态相关联。b, 白细胞动力学数据的示意图。点状图表示基于观察到的中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞每日变化的主成分（PC），包含了没有微生物数据的样本（灰色；n =20751 （中性粒细胞移植后）,总计81253）和有微生物数据的样本（橙色；n =2651（中性粒细胞移植后），总计6297）。EV，解释的方差。c, 外周血干细胞移植（PBSC）受体病人所提供的最多的血液动力和微生物的配对样本（n =995）。来自CD34+选择移植物（TCD）造成的T细胞离体耗竭病人，骨髓移植病人（BM）和脐带血移植（cord）病人用作验证。d-f, 来自基于外周血干细胞移植（PBSC）受体病人数据的贝叶斯推断结果。d, 不同治疗间关联性的后验系数分布（不同颜色表示大于0（红色）或者小于0（蓝色）的超过95%后验密度（PD）的系数估计）。MM，霉酚酸酯。e,白细胞数量。f, 细菌属的相对丰度和中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的每日变化(Δ)。v值（v-score）表示成功验证相关性的队列数量；如果无法在队列中验证的话则为0。Unid，未确认的。g, 含有最高（左）或者最低（右）相对丰度费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)的100个微生物样本。h, 从含有最高（蓝色）或者最低（红色）相对丰度费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)的样本（g图）随机取样，模拟的在GCSF存在下的中性粒细胞动态和微生物的组成。折线表示1000次模拟的中值，阴影区域表示模拟轨迹的四分位数范围。i, 在GCSF不存在的等效模拟下，中性粒细胞第一次到达每微升2000个细胞密度的时间。
总之，这项研究通过外周血白细胞的动态过程将人体肠道菌群和免疫系统动力学联系了起来。研究者直接使用从人类受试者中的白细胞计数，这是大规模进行的粒化临床分析，但也缺乏诸如淋巴细胞和其他免疫细胞亚型的详细信息。因为该研究针对人体，所以当微生物组-免疫相互作用的动物模型的临床相关性受到质疑时，它填补了微生物组研究关键时刻的重要空白。通过长期研究大量患者，研究者可以推断和量化肠道菌群与系统免疫细胞动力学之间的关联，这些结果有助于阐释清楚先前明显矛盾的发现。研究者对微生物群影响人体系统免疫力的论证，在免疫介导的炎症性疾病中，为探索潜在的针对微生物群的干预措施来改善免疫疗法打开了大门。 我们已知肠道菌群在人体免疫系统的发展和稳态中起到了重要作用，但是菌群和免疫细胞间的相互作用还有很大的认知空间。笔者认为本研究能够发在顶刊Nature上有以下三大亮点： 1）极其难得横向和纵向研究队列。本研究纳入了美国数以千名接受造血细胞移植的癌症病人的血液白细胞计数，临床数据和肠道微生物数据，并进行了长达100多天的数据跟踪收集，首先从数据意义上，就为今后研究造血细胞移植病人术后的临床特征，免疫反应以及肠道微生物提供了不可估量的珍贵资源； 2）精彩的实验设计。研究者所提出的科学问题和假设思路清晰，层层递进。例如，首先从现象入手（观察到造血细胞移植后病人的免疫细胞恢复），到因果分析挖掘（通过粪菌移植的随机实验证实细菌可以促进免疫系统恢复），再到特定肠道细菌的研究（发现费氏杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌属(Ruminococcus2)和阿克曼菌属 (Akkermansia)是免疫系统重建的最大贡献者），最后巧妙的量化这些细菌的影响程度（这三种细菌高丰度可以缩短免疫恢复的时间）； 3）最后，这项研究量化了肠道菌群与系统免疫细胞动力学之间的关联，为造血细胞移植，乃至其他免疫介导疾病的微生物干预措施提供了重要的理论基础。
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