一、实验原理 PCR 全称聚合酶链式反应(英文:Polymerase chain reaction),是利用DNA双链复制的原理,在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术,其特点是可以以微量的DNA为模板,快速扩增得到大量拷贝。原理是基于DNA 半保留复制与碱基互补配对原则,是在体外模拟DNA的天然复制过程,主要由'变性-退火-延伸’这三个基本步骤构成,变性:DNA双链在高温条件(95℃)下解旋形成单链;退火:降低温度可使引物结合到单链DNA上,DNA聚合酶结合到引物上;延伸:DNA 聚合酶在其最适反应温度(72℃)开始沿着DNA链5'-3' 方向合成互补链。随着PCR 的进行,生成的DNA本身将作为模板,从而启动链式反应,原始DNA模板被指数扩增。 二、实验试剂 Taq酶,M-MLV逆转录酶,dNTPs, DEPC处理水,双蒸水 三、实验仪器 电泳仪, PCR仪,高速离心机,移液器,电泳仪,电泳槽,紫外分析仪 四、操作步骤 1.cDNA的合成 逆转录体系的组成: 2.PCR扩增特异性片段 25ul PCR体系的组成: 五、实验注意事项 整个操作始终注意避免RNA酶的污染; PCR反应灵敏,注意避免试剂污染; 酶易失活,整个操作注意在冰上进行。 设立对照:阳性对照:阳性模板,阴性对照:阴性模板,试剂对照:除模板外的所有组分。 |
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