科研 | Nature子刊：阿卡波糖生物合成过程中中间产物向分流产物的严重流失（国人佳作）

编译：有点卡，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖是含C₇N-氨基环己醇天然产物的重要代表之一，主要用于Ⅱ型糖尿病的临床治疗，对肠道麦芽糖酶、蔗糖酶、糊精酶和糖化酶具有竞争性抑制活性，能延迟碳水化合物的吸收并控制餐后高血糖。由于Ⅱ型糖尿病在世界范围内越来越普遍，市场对阿卡波糖的需求迅速增加，为了大幅度提高阿卡波糖的效价，本文利用代谢组学分析、生化实验等方法对游动放线菌SE50/110生物合成阿卡波糖的代谢途径进行研究，阐明了C₇-环己醇部分的合成过程，并找到阿卡波糖生物合成过程中中间代谢产物的流失方向，以及阿卡波糖的生产瓶颈；此外，本文通过最大限度地减少流向分流产物的代谢通量，最大限度地提高氨基脱氧己糖部分的供应等代谢策略，将阿卡波糖的效价增加1.2倍，达7.4g/L。同时，本文对阿卡波糖C₇-环己醇部分的研究，有助于更好地理解其他C₇N-氨基环己醇的生物合成过程。

论文ID

原名：A severe leakage of intermediates to shunt products in acarbose biosynthesis

译名：阿卡波糖生物合成过程中中间产物向分流产物的严重流失

期刊：Nature Communications

IF：11.878

发表时间：2020.01

通讯作者：白林泉

作者单位：上海交通大学生命科学与生物技术学院&塔里木大学生命科学学院

实验设计

实验结果

1. 阿卡波糖生物合成过程中两种主要分流产物的发现

游动放线菌SE50/110（Actinoplanes sp.）发酵液的高效液相色谱（HPLC）分析结果显示，在7.5 min的保留时间位置发现一个强吸收峰（P-1），而阿卡波糖(1)的吸收峰出现在20.8 min（图2a）。为了验证P-1峰是否与1有关，我们敲除了游动放线菌SE50/110的整个acb基因簇（32.2 kb），记作QQ-3；结果表明，敲除株QQ-3发酵液中P-1和1同时消失，而利用质粒pLQ666回补acb簇后，两个吸收峰再次同时出现（图2a），P-1和1的同时消失和恢复表明这两个峰之间存在相关性。

将P-1纯化后进行核磁共振（NMR）波谱结构分析，发现该吸收峰由1-epi-valienol(8)和valienol(9)组成（附图1-10，附表2，图2b），将这两种化合物经三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后，通过气相色谱-四极杆质谱（GC-QMS）分析（附图11），结果显示，游动放线菌SE50/110的4天发酵液中，8和9分别积累2.5 g /L（14.2 mM）和1.6 g/L（9.1 mM），而1的效价仅3.1 g/ L（4.8 mM）。为了探究8和9是否为1的水解产物，将1与acbC缺失株QQ-4共孵育（附图12），结果并未检测到8或9，表明它们不是1派生的（附图13）。

为了研究8和9是否能结合到1中，将两种化合物和2-epi-5-epi-valiolone（3）（1中C₇-环己醇部分的前体）分别与缺失株QQ-4孵育，结果表明，加入3能使1大量积累，而8或9与缺失株孵育后并未检测到1的产生（图2c），这表明8和9是分流产物，而不是1生物合成的前体或中间代谢产物。

图1游动放线菌中阿卡波糖的生物合成。(a) 阿卡波糖(1)的生物合成基因簇（acb簇，GenBank登录号：Y18523.4）。(b) 1的生物合成途径，包括已确定的生物合成步骤（蓝色箭头）、未经实验确认的可能步骤（灰色虚线箭头）、已有报道提出的生物合成步骤（灰色箭头）、本研究确定的生物合成步骤（绿色箭头）以及根据本研究新增的生物合成步骤（紫色箭头）； C₇-环己醇部分（蓝色）、氨基脱氧己糖部分（黄色）、分流产物（紫红色）以及已有报道提出的C₇-环己醇部分（灰色）的生物合成途径通过高光突显。

图2游动放线菌SE50/110发酵液中分流产物的发现和鉴定。(a) 原始游动放线菌SE50/110（简称SE50/110）、Δacb敲除株QQ-3和回补株QQ-3::pLQ666的HPLC图谱。(b) 1-epi-valienol(8)和valienol (9)的结构。(c) 3（阳性对照）、8或9分别与ΔacbC敲除株QQ-4共孵育后产物中1的HPLC-QQQ/MS，未处理的QQ-4发酵液作为阴性对照，std为标品。数据见源数据文件。

2. 中间产物C₇-环己醇的去磷酸化

根据预测的1生物合成途径（图1b），我们假设8是由1-epi-valienol-7-P (10)在一种磷酸酶的作用下衍生而来，为了从生化角度验证这一假设，我们通过8与已知的C₇-环己醇激酶ValC孵育来制备化合物10，该激酶是参与吸水链霉菌井冈变种500825（Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis）生物合成井冈霉素的关键酶。结果显示，ValC能磷酸化8生成10（m/z=255.0308[M-H]^-），此外，ValC还能催化9磷酸化生成valienol-7-P(11)（附图14-16，附表3）。

找到化合物10和11的转化方法后，我们决定寻找去磷酸化酶。蛋白AcbJ与卤代酸脱卤酶样（HAD）超家族中的水解酶序列高度相似，最初预测是负责10去磷酸化的关键酶（附表1）。将该酶在大肠杆菌中表达并纯化，发现AcbJ的确能有效使10去磷酸化变成8（图3a）。为了进一步在体内研究AcbJ的功能，我们将游动放线菌SE50/110的acbJ基因沉默，得到突变株QQ-5，该突变株与游动放线菌SE50/110相比，磷酸酶活性下降了76.4%，表明AcbJ在10的去磷酸化过程中起主要作用。然而，acbJ沉默后1不再产生，而回补acbJ后1的产生也随之恢复（附图17），这表明acbJ对1的生物合成是必需的。而基因acbJ沉默后，8仍存在积累且存在残余的磷酸酶活性，这可能是位于acb基因簇外的其他编码酶也参与10的去磷酸化造成的。

为了进一步寻找其他潜在的水解酶，我们利用BLASTP程序鉴定了4个与AcbJ序列同源的候选蛋白（ACPL_8310、ACPL_8309、ACPL_6858和ACPL_7709），且游动放线菌SE50/110的转录组分析结果显示，4个HAD超家族水解酶（ACPL_2834、ACPL_1897、ACPL_560和ACPL_7310）选择性高表达（附表4）。将这些酶纯化后分别与10孵育，发现ACPL_8310，ACPL_2834和ACPL_7709能催化10去磷酸化（图3a；附图18a），ACPL_8309也显示出较弱的催化活性。有趣的是，11也能被这五种对10有活性的酶催化去磷酸化形成9（图3b；附图18b和19b），而acbJ的缺失导致9的累积减少66.9%（附图17c）。

图3参与10和11去磷酸化的水解酶的鉴定。(a,b) AcbJ, ACPL_8310, ACPL_2834, 或ACPL_7709 体外催化10和11去磷酸化反应后产物的HPLC-TOF/MS分析，无酶反应设为阴性对照，红色为8、9的标品。所有色谱图均为两个特征离子同时提取：8和9，m/z=211.0379[M+Cl]^-；10和11，m/z=255.0275[M-H]^-。数据见源数据文件。

3. C₇-环己醇生物合成过程的进一步解析

由于ValC能在体外磷酸化8和9分别生成10和11（附图14），因此可以在将染色体上整合了valC基因的突变株QQ-4::valC中尝试体内循环8和9。根据生物合成途径（图1b），可以通过回收8形成假定的中间产物10，进而产生1。但我们分别用8和9进行孵育发现，只有加入9才能促进QQ-4::valC突变株产生1，这表明11才是1生物合成过程中的真正中间产物（附图20）。为了进一步阐明1的生物合成途径，我们决定重新探究AcbL的生化功能，AcbL是一种环醇脱氢酶，预测其能催化4的C-1羰基还原，生成5-epi-valiolol-7-P（附表1；图1b）。我们从吸水链霉菌井冈变种TL01ΔvalD的发酵液中分离出3，再利用AcbM和AcbO催化得到化合物4（附图21）。有趣的是，纯化得到的AcbL与4和NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯）孵育后的产物中检测到m/z=253.0121的物质（图4a），与valienone-7-P（12， 253.0119[M-H]^-）的m/z一致（附图22a）。而反应混合物与磷酸酶AcbJ共孵育后得到的去磷酸化产物为valienone(13)（图4b；附图22,23）。在该反应中AcbL的首选辅因子为NADPH（附图24）。以上结果表明，AcbL能催化4脱水形成12（图1b）。此外，在游动放线菌SE50/110的发酵液中检测到微量的13（~20 mg/L），可能是通过中间产物12去磷酸化后衍生而来。化合物13是阿卡波糖生物合成过程中的另一个分流产物（图1b；附图25）。

AcbN是短链脱氢酶家族中的一种NADPH依赖性氧化还原酶（附表1），预测其能催化12的还原。为了验证这一假设，我们利用ValC磷酸化13得到12（附图26；附表5），再与纯化后的AcbN和NADPH共孵育，得到的产物中检测到m/z=255.0319的物质，这与10和11一致（255.0275[M-H]^-）（图4a；附图14c）。为了进一步确定该物质的结构，我们随后加入AcbJ，GC-QMS检测结果表明该物质去磷酸化后的产物为9（图4b），这表明AcbN能催化12转化为11（图1b）；而核磁共振波谱结果也进一步验证其确为11（附图27-30；附表5）。该反应的首选辅因子也是NADPH（附图31）。为了测试AcbN能否逆向催化，将纯化的AcbN同11和NADP⁺孵育，结果生成了大量的12（图4a，b），但AcbN与10孵育后并未检测到产物（附图32），表明AcbN能特异性识别11。以上结果表明，AcbN能促进12和11之间的相互转化，分流产物9是11去磷酸化后得到。至此，1的C₇-环己醇部分经过2到11五个步骤的生物合成过程已被完全解析出来（图1b；附图33）。

图4通过表征AcbL和AcbN催化的转化进一步阐明C₇-环己醇部分生物合成途径(a) 12的标品，AcbL与4、热失活的AcbL与4、AcbL与12、热失活的AcbL与12、AcbL与11、热失活的AcbL与11反应产物的HPLC-TOF/MS分析。所有色谱图均为相应离子的提取离子色谱图。(b)  AcbJ催化去磷酸化后反应产物的GC-QMS分析。将AcbJ分别加入AcbL与4、热失活的AcbL与4、AcbL与12、热失活的AcbL与12、AcbL与11、热失活的AcbL与11反应后的产物中，13、8和9的标品经BSTFA衍生后进行GC-QMS分析。所有色谱图均为相应离子的提取离子色谱图。TMS即三甲基硅基（trimethyl silicyl）。详见附图11,23，数据见源数据文件。

4. 1-epi-valienol部分的生物合成

由于AcbN已被证明能特异性催化12还原为11，因此分流产物10也很可能是通过其他氧化还原酶从12衍生而来。为了证明这一假设，我们敲除了游动放线菌SE50/110的acbN基因，得到的敲除株SE50/110ΔacbN无法产生9和1，但仍能产生大量得8，这表明8和9是通过不同途径合成的（附图34）。随后，我们将12分别与敲除株SE50/110ΔacbN、QQ-3（敲除了基因簇acb）以及游动放线菌SE50/110的无细胞提取物（CFE）孵育，均能检测出大量10和/或11（m/z=255.028，calc.255.0275[M-H]^-）（图5a；附图14c）。然后再利用AcbJ对产物去磷酸化，并进行GC-QMS分析，将SE50/110ΔacbN和QQ-3的CFE反应后产物与8孵育，游动放线菌SE50/110的CFE反应后产物与8和9孵育（图5b）；其中QQ-3的CFE反应后产物纯化后，经核磁共振波谱验证其为10（附图35-39；附表6）；由于acb基因簇中除acbN外并没有被注释为氧化还原酶的ORF（附表1），因此推断12是被acb簇外的基因编码酶还原成10的。

为了鉴定参与该反应的酶，我们通过阴离子交换色谱法将QQ-3细胞裂解液中的所有蛋白分为34个组分（附图40a），并以12为底物测定每个组分的还原酶活性。通过蛋白质组学分析显示，组分15（F15）和24（F24）分别在NADPH和煮沸无细胞提取物（BCF）存在下具有最高还原酶活性，而F10未检测到活性（附图40b）。随后我们对F15和F24中可行且高丰度（UniquePepCount≥4）的假定氧化还原酶进行生物化学分析（附图40c；附表7），发现F15中的蛋白ACPL_7966， ACPL_7511和ACPL_5736以及F24中的蛋白ACPL_7667，ACPL_5740和ACPL_4412具有还原酶活性（图5a,b；附表7）。这些结果证实分流产物8是从生物合成中间产物12分支，经还原和去磷酸化得到的（图1b；附图41）。

图5分流产物8生物合成途径的说明。

(a)游动放线菌SE50/110、SE50/110ΔacbN和QQ-3的无细胞粗提物（BCF）、纯化的ACPL_7966, ACPL_7511 和 ACPL_5736蛋白与12反应后还原产物的HPLC-TOF/MS分析，沸水处理的BCF设为阴性对照。所有色谱图计算离子m/z=255.0275[M-H]^-。(b) AcbJ催化去磷酸化反应产物的GC-QMS分析。将AcbJ分别加入游动放线菌SE50/110、SE50/110ΔacbN和QQ-3的无细胞粗提物以及纯化的ACPL_7966, ACPL_7511 和 ACPL_5736蛋白中催化反应。8和9的标品经BSTFA衍生后进行GC-QMS分析。详见附图11，所有色谱图均提取特征离子m/z=332.2。TMS即三甲基硅基，数据见源数据文件。

5. 最小化流向分流产物的代谢通量

原始游动放线菌SE50/110发酵4天后共产生8和9 4.1 g/L（23.3 mM），而1仅3.1 g/L（4.8 mM）（补充图11），这表明分流途径导致C₇-环己醇的中间产物11和12出现严重流失，这也是1生物合成中的关键节点之一。因此，我们认为可以利用代谢工程策略，通过将分流产物的代谢通量转移至磷酸化的C₇-环己醇（11和12），以提高1的产量，可采用策略如降低磷酸酶活性，降低12向分流产物10的转化率，以及增强12转化为中间产物11的效率（图6a）。

AcbJ是10和11去磷酸化的主要磷酸酶，但其同时也是1生物合成的关键酶，因此不能敲除（附图17）；但我们可以用弱启动子调节acbJ的表达水平，将不同强度启动子启动的acbJ表达盒分别导入acbJ缺失株QQ-5中。结果表明，kasOp*启动子作用下，相比于对照菌株SE50/110::pSET152磷酸酶活性降低至54.2%，且1的效价和产量（1的滴度与细胞干重之比）增加（附图42）；随后将表达盒kasOp*-acbJ整合到QQ-7（将QQ-5的水解酶基因ACPL_8310敲除后，插入弱启动子WVp和无启动子区域的水解酶基因ACPL_2834得到）染色体上（附图43）。结果菌株QQ-8的1的效价和产率分别提高了18.8%和30.3%（图6b；附图44a），而8和9的累积量分别减少了7.1%和58.3%（图6c），磷酸酶活性减少了59.8%（附图44b），内源性10和11总量增加了1.2倍（附图44c），生物量减少了8.8%（附图44d）。

为了抑制12流向10，并促进12到11的转化率，我们在QQ-12（在QQ-8的基础上连续敲除氧化还原酶基因ACPL_7966、ACPL_7511、ACPL_5736和ACPL_7667）中过表达acbN（AN）（图6a），虽然1的效价并无明显提高且生物量也无明显变化，但9的积累量增加了30.0%， 8的积累量减少了5.8%（图6b,c；附图44e），这表明acbN的过表达可以提高12对11生物合成的竞争利用率。

6. 最大化氨基脱氧己糖部分的生物合成

尽管上述代谢工程策略在一定程度上增加了1的效价，包括中间产物11在内的胞内磷酸化C₇-环己醇在突变株QQ-12中大量累积（图6a-c；附图44），这意味着这些C₇-环己醇中间产物利用的低效已成为1生产过程中的主要瓶颈（图1b）。为了寻找限速步骤，我们对游动放线菌SE50/110发酵24、48或72h的转录组进行分析，研究参与1生物合成基因的转录水平，发现在三组转录组中磷酸葡萄糖变位酶基因pgmA（ACPL_2870）以及4,6-DH基因acbB（一种对6的生物合成至关重要的基因）的转录水平显著低于其他基因（附图45a）。因此，我们用kasOp*启动，分别在游动放线菌SE50/110中过表达了pgmA和acbB，与对照株SE50/110::pSET152相比，各自的转录水平分别提高了89.2倍和2.7倍（图6d；附图45b-d），而pgmA和acbB转录水平的增加直接导致1的效价分别增加了8.1%和9.7%（图6e），产量分别增加了16.0%和15.0%（附图46a），8的积累量分别减少了15.1%和22.3%，9的积累量分别减少了9.4%和20.4%（图6f）。且两基因的过表达对生物量积累无显著影响（附图46b）。以上结果表明，磷酸葡萄糖变位酶和4，6-DH活性不足是限制1的产生的因素之一。

由于acbB的转录水平仅提高2.7倍，并未达到理想水平，我们在游动放线菌SE50/110中多拷贝acbB（ABn）并同时过表达pgmA（AP）（图6d）。结果显示，与SE50/110::pSET152相比，携带AP-AB₂表达盒的突变株acbB的转录水平和4,6-DH活性分别增加了4.4倍和2.5倍，1的效价和产量分别提高了23.4%和29.1%（图6e；附图46a,c,d），8（21.3%）和9（27.2%）的积累减少，内源性10和11总量减少了10.4%，而生物量无明显变化（图6f；附图46b,e）。

为了避免acbB多拷贝导致遗传不稳定，我们分别利用耻垢分枝杆菌MC2 155（MB）、铜绿假单胞菌M18（PB）和大肠杆菌K12 W3110（EB）编码高酶活4,6-DHs的异源基因与AP共表达。结果显示，与SE50/110::pSET152相比，引入AP-MB表达盒使4,6-DH活性提高了1.9倍，1的最高效价和产量分别提高了28.9%和33.5%，8和9的积累分别减少了25.6%和18.8%，内源性10和11的总量减少了23.4%，但生物量无明显变化（图6e,f；附图46a,d–g）。

为了进一步提高前体物质5的利用，促进6的生物合成，我们在游动放线菌SE50/110中共表达G-1-PT同源基因和AP-MB表达盒（图6d）。与SE50/110::pSET152相比，引入AP-MB-EA表达盒后G-1-PT活性增加3.5倍，1的最大效价和产量分别增加了45.7%和56.9%，8和9的积累分别减少了50.6%和46.5%，内源性10和11总量减少了35.2%，生物量减少了6.9%（图6e,f；补充图46a,e-h）。

图6最小化流向分流产物通量和最大化氨基脱氧己糖部分生物合成的组合代谢工程策略。

(a) 使分流产物的代谢通量流向1的策略示意图。

(b,c) 游动放线菌SE50/110（简称SE50/110）、QQ-8（在QQ-7染色体上整合了kasOp*-acbJ以下调acbJ表达）、QQ-9（敲除了QQ-8的ACPL_7966基因）、QQ-10（敲除了QQ-9的ACPL_7511基因）、QQ-11（敲除了QQ-10的ACPL_7536基因）、QQ-12（敲除了QQ-11的ACPL_7667基因）、QQ-12::pSET152（对照）和QQ-12::AN（在QQ-12中过表达acbN基因）发酵4天后1、8和9效价，详见附图42-44。

(d) 提高氨基脱氧己糖部分生物合成过程中，基因剂量或酶活性的逐步优化示意图。

(e,f) 携带pSET152（对照）及分别含有AP、AB、AP-AB₁、AP-AB₂、AP-AB₃、AP-AB₄、AP-AB₅、AP-MB、AP-PB、AP-EB、AP-MB-AA、AP-MB-MA、AP-MB-PA或AP-MB-EA表达盒的衍生质粒的菌株发酵4天后1、8和9的效价，采用配对t检验（双尾）。误差线：平均值±标准差（3个生物学重复）。详见附图45,46。图6b,c,e,f的数据见源数据文件。

7. 有效代谢工程策略的整合

结合所有有效的代谢工程策略进一步提高1的合成，我们将AP-MB-EA和AP-MB-EA-AN表达盒分别导入到突变株QQ-12中。AP-MB-EA的表达使1的效价提高了64.8%，而AN的引入使1的效价进一步提高了17.0%（图7a,b；附图47）。与对照菌株SE50/110::pSET152相比，最佳工程菌株QQ-12::AP-MB-EA-AN分批补料发酵6天后，1的产量为7.4g/L，效价提高了1.2倍，产率提高了2.3倍，8减少了20.2%，9减少了67.1%（图7c,d），而生物量减少了33.0%（附图47c）。

图7有效代谢工程策略的整合(a,b) SE50/110::pSET152（对照）、QQ-12::pSET152（对照）、QQ-12::AP-MB-EA和QQ-12::AP-MB-EA-AN发酵4天后1、8和9的效价。采用配对t检验（双尾）。

(c,d) SE50/110::pSET152（菱形）和QQ-12::AP-MB-EA-AN（圆形）的分批补料发酵。用颜色显示1（橙色）、8（灰色）和9（绿色）效价随发酵时间的变化。误差线：平均值±标准差（3个生物学重复），详见附图47。数据见源数据文件。

讨论

阿卡波糖（1）是目前应用最广泛的抗糖尿病药物之一，尽管其临床应用已达十年之久，但1的生物合成过程仍然没有被完全解析，已有报道揭示了2到4 的生物合成步骤，但进一步的下游合成途径还未得到生物化学实验验证。最近，有人提出pyralomicin中环醇部分的合成涉及4脱水形成12，再还原后形成11，但所提出的酶PrlW（环醇氧化还原酶）和PrlV（环醇脱氢酶）的功能尚未得到实验验证。本研究结合代谢分析、化学和生化实验，阐明了AcbL和AcbN的功能，不仅在1生物合成的研究中取得了突破性进展，而且有助于更好地理解其他C₇N-氨基环己醇的生物合成过程。

因此，前人提出的1中C₇-环己醇部分的后续生物合成步骤新增为11磷酸化为valienol-1,7-diP，再核苷酸化生成NDP-valienol-7-P（图1b）。尽管我们已通过基因敲除的方法证明AcbJ是游动放线菌SE50/110生物合成1所必需的（附图17），但其确切功能仍不清楚，由于AcbJ能够催化11去磷酸化，我们推测其负责将中间产物valienol-1,7-diP、NDP-valienol-7-P或dTDP-acarviose-7-P的C-7磷酸基团水解（图1b），这也将是我们未来关于1生物合成的研究课题。

根据用¹³C标记的8和13孵育的结果，发现这些化合物均未进入1中这表明这两种化合物都是从中间产物12中分支出去的分流产物（图1b；附图33）。此外，虽然在游动放线菌SE50/11037的CFE中8可以通过激酶转化为10，但该反应似乎不是1生物合成的一部分或再生途径，因为研究表明10也是直接从12衍生的分流产物（图1b和5）。另据报道，游动放线菌SE50/110的CFE对9有较弱的激酶活性，并可能产生少量的11。然而，我们的研究结果表明，用9与QQ-4孵育后并未检测到1的产生，除非C₇-环己醇激酶基因valC被整合到染色体上，如QQ-4::valC（图2c；附图20），这表明弱激酶产生的1可能不足用于检测。

已鉴定的分流产物8、9、10和13是中间代谢产物11和12的分支（图1b），这是由于所涉及的磷酸酶和氧化还原酶的底物特异性不强，从而在分流途径、1的生物合成和初级代谢之间建立了复杂的相互作用。在这个网络中，AcbJ是一个关键节点，控制了流向1和分流产物的代谢通量。同样，假定的水解酶（ACPL_8310）、β-磷酸葡萄糖变位酶（ACPL_2834）、海藻糖6-磷酸磷酸酶（ACPL_7709）、gfo/Idh/MocA家族的氧化还原酶（ACPL_7966）、肌醇2-脱氢酶（ACPL_7511）、葡萄糖6-磷酸脱氢酶（ACPL_5736），脂肪辅酶A脱氢酶（ACPL_7667）在初级代谢中起着重要作用，也参与了分流产物的生物合成。据此推测，在其他C₇N-氨基环己醇的生物合成途径中也存在类似的分流途径。

细胞内磷酸化代谢产物过高通常是有毒性的，将会抑制细胞生长。如与游动放线菌SE50/110相比，acbJ的缺失导致细胞内磷酸化C₇-cyclitols（10和11）显著增加，同时生物量明显减少（附图17），便证实了这一点。此外，在不同强度的启动子的控制下，由于acbJ的反式互补作用，使得内源性10和11总量随着磷酸酶活性的增加而减少，生长抑制也逐渐减轻（附图42）。这些证据表明，通过磷酸酶和去磷酸化产物（8和9）的流出，积累的磷酸化C₇-环己醇（10和11）的去磷酸化是细胞解毒过程的一部分。但acbJ的缺失仅导致9的累积量显著减少，而对8无明显影响的原因仍不清楚（附图17c）。我们推测，可能是由于acbJ缺失株1的生物合成受阻以及过低的去磷酸化活性，引起中间产物11被AcbN反向氧化为12，然后被还原酶还原为10（图1b），从而使8的浓度相对恒定，不过这一假设需要对胞内的10和11进一步定量证实。

我们发现，由于氨基脱氧己糖部分的合成不足使得代谢不平衡是导致C₇-环己醇中间产物流失的另一个关键因素。因此，我们采用多种策略来减少分流产物的代谢通量却只增加了少量的1，但胞内磷酸化的C₇-环己醇浓度却显著增加（图6a,b；附图44c）。这与最近的一项研究结果一致：在该研究中，游动放线菌SE50/110中acbC的过表达仅提高了11，而不是1的产生。

此外，acbB的转录水平低似乎是一种普遍现象，在不同发酵介质中培养的游动放线菌SE50/110的转录组分析中均发现了这一现象。于是我们采用了两种合成生物学策略来调节4,6-DH的活性：（1）通过调节基因的拷贝数来平衡acbB与其他acb簇基因的转录水平；（2）在大肠杆菌、耻垢分支杆菌和铜绿假单胞菌中寻找催化活性较高的异源酶。两种策略都成功地提高了氨基脱氧己糖部分的合成能力（图6e；附图46）。高效异源的G-1-PTs显著提高了1的效价，也进一步证明将初级代谢转移到次级代谢的酶的过表达是一种有用的策略（图6e）。因此，这些结果展现了利用各种高效异源同工酶优化生物合成途径的潜力。

然而，由于已鉴定的、甚至更多未鉴定的水解酶和氧化还原酶的底物不特异使得分流产物积累，因此最佳工程菌株的发酵液中仍保留约58.4%的分流产物（12.2 mM 8和4.3 mM 9）；而且11.6mM分流产物的减少仅令1的效价增加6.2mM（图7c,d），这表明其他5.4mM C₇-环己醇中间产物仍在细胞内或被其他未知的竞争代谢途径利用（附图47d）。以上结果说明最大限度地利用C₇-环己醇中间产物提高1的效价这一策略的潜力，以及开展生物合成和扩展遗传工具箱的重要性。此外，优化发酵策略，最佳工程菌株1的效价有望进一步提高。

总的来说，本研究采用系统的代谢工程策略，最大限度地减少流向分流产物的代谢通量，最大限度地供应氨基脱氧己糖部分以平衡与C₇-环己醇部分的通量，以促进中间产物C₇-环己醇在1的生产中的有效利用。本研究致力于揭示和微调1的生物合成网络，同时通过代谢工程途径寻找其他C₇N-氨基环己醇生物合成的代谢瓶颈并提高产量。

评论

α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖由放线菌SE50/110产生，是治疗Ⅱ型糖尿病的著名药物，本文从产物检测开始一步一步剖析，详细阐述了如何判断分流产物，确定真正的中间代谢产物。阿卡波糖的结构由三部分组成：不饱和C₇-环己醇、氨基脱氧己糖和麦芽糖。本文主要通过提高C₇-环己醇、氨基脱氧己糖两个模块的合成，逐个减少分流产物的积累，提高阿卡波糖效价，采用包括转录组、代谢组、蛋白质组分析、基因工程和生化实验等多种研究方法，工作量极大，是值得一看的通过代谢工程策略提高产品产量的文章。

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