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编译：阿昊，编辑：谢衣、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：Metabolic profile and underlying antioxidant improvement of Ziziphi Spinosae Folium by human intestinal bacteria 译名：酸枣叶经过人类肠道菌群代谢后的代谢图谱以及其抗氧化作用 期刊：Food Chemistry IF：5.399 发表时间：2020.03 通讯作者：杜晨辉 作者单位：山西中医药大学 实验设计 样品采集： 将LZJS（500 g）在阴凉处干燥并粉化。将细粉末用50％乙醇（6L）在回流下萃取两次（每次0.5小时）。合并萃取液并浓缩至1 L，LZJS的浓度为0.5 g / mL。萃取液用大孔树脂纯化，然后依次用水，10％乙醇和50％乙醇洗脱。弃去水和10％乙醇部分。收集50％的乙醇部分，然后冷冻干燥以获得LZJSF提取物，用于进一步的实验。 新鲜的粪便样本是由六名健康志愿者（三名男性和三名女性，年龄在22-26岁）捐赠的，他们遵循正常的中国饮食并且在研究前至少三个月未接受抗生素治疗。首先，将来自六名健康志愿者的样品混合，收集到无菌小瓶中，用灭菌的磷酸盐缓冲液制成10％（w / v）的悬浮液，通过两层无菌纱布海绵过滤并在6000 rpm（4°C）下离心10分钟。然后，将过滤后的悬浮液（10 mL）加入培养基（10 mL）中，并在37°C的厌氧培养箱中（5％H2、10％CO2，和85％的N2）孵育9 h。最后，将1 mL无菌LZJSF提取物添加到悬浮液中（20 mL），在37°C下温育48 h，并在8个时间点（0、1、2、4、6、8、24和48 h）收集FLZJSF样品，以通过LC分析两种成分-MS和抗氧化活性检测。同时，将在0小时的FLZJSF样品视为LZJSF。不含LZJSF和肠道微生物细菌的发酵液分别作为Control-1和Control-2。一式三份重复所有实验。 在每个时间点将培养的FLZJSF混合物分别用水饱和正丁醇萃取。蒸发提取物，并将残余物溶于水（2mL）中，然后在4℃以14000rpm离心20分钟。将所得的上清液（1.6mL）分成两部分。用UPLC-MS分析了一部分（0.8 mL），另一部分（0.8 mL）用于抗氧化活性实验。 实验结果 1 LZJSF中的化合物和FLZJSF中的代谢产物 为了表征LZJSF中的化学化合物，建立了使用full mass/dd-MS2（Top5）扫描模式的UHPLC-Q-Orbitrap-MS方法。在本研究中，共鉴定了18种类黄酮化合物（表1），其中9种通过与参考标准品进行比较得到了确认。对于其他9种化合物，根据早期的研究结果，发现同源化合物具有共同的结构骨架，因此，具有类似片段的化合物可以分配给特定的化学家族。同时，化合物2、9、16和18共享C15H10O6片段。通过查询数据库，可以将上述特征片段分别分配给槲皮素（quercetin）和山柰酚（kaempferol）家族。 与两个对照相比，通过使用PIL触发的目标检测来识别潜在的代谢物。通过与标准品进行比较，在FLZJSF样品中总共鉴定出7种酚酸代谢物。 图1. 通过HIB发酵的FLZJSF样品中的槲皮素类黄酮（A）和山柰酚类黄酮（B）的代谢途径。蓝色的结构表示LZJSF提取物中的主要类黄酮。 2 FLZJSF提取物中代谢途径和化合物含量的分析 根据以上实验的结果，FLZJSF在 HIB中的代谢途径如图1A和B所示。Bothquercetin-3-O-Rut（Glu + Rha）和quercetin-3-O-Rob（Gal + Rha）最初被降解为quercetin-3-O-β- D-Glu和quercetin-3-O-β-D-Gal。然后，将quercetin-3-O-β-D-Glu和quercetin-3-O-β-D-Gal分别通过Glu和Gal的水解进一步转化为糖苷槲皮素。槲皮素是quercetin -3-O-β-D-Glu，quercetin-3-O-β-D-Gal和quercetin-3-Rha的常见中间产物，它们分别在1、2和8 h时几乎全部降解（表2）。其中，quercetin -3-O-β-D-Glu降解最快，而quercetin -3-Rha降解最慢。此外，quercetin -3-O-Rob（Gal + Rha）在最初的2 h内保持平衡，并在6 h时几乎完全降解，而quercetin -3-O-Rut（Glu + Rha）在6h后才消失，这表明quercetin -3-O-Rob的降解速率较慢。结果与本文先前的研究相符。 表1. 采用UHPLC-Q-Orbitrap-MS/MS检出的黄酮类化合物和酚酸化合物。
3肠道菌群分析 为了解FLZJSF提取物中肠道菌群组成与成分多样性之间的相关性，进行了16S rRNA基因序列分析。稀疏度曲线未达到平稳状态。但是，三个样本的香农指数是稳定的。在HIB所有样本中发现了9个门，和38个属，其中最为丰富的菌种是双歧杆菌（Bifidobacteria）。 4在化学水平上的抗氧化活性 在化学水平上，FLZJSF在8个时间点的抗氧化能力是通过体外化学方法确定。DPPH是一种稳定的自由基，已被广泛用于评估食品提取物和生物活性化合物的抗氧化活性。O 2-是激发自由基的前体，并具有通过与生物大分子（脂质，蛋白质和DNA）反应而引起组织损伤的潜力。 如图2A所示，FLZJSF样品（最终浓度分别为0.01、0.03和0.06mg / mL）在4h和6h发酵处理条件下可以显著提高DPPH自由基清除活性（p <0.001），特别是在孵化时间为4 h时。然而，与0小时的FLZJSF相比，FLZJSF在8、24和48小时的DPPH清除活性没有显着差异。同样，如图2B所示，在4h和6h的FLZJSF样品（最终浓度分别为0.01、0.02和0.04mg / mL）也显示出最高的O2-清除活性，而在HIB发酵后8h观察到O2清除能力值明显下降（p <0.001），与DPPH清除活性和O2-清除活性相似。简而言之， FLZJSF样品在4和6 h时具有较高的抗氧化能力。 图2. （A）FLZJSF的DPPH自由基清除能力和（B）O2-自由基清除能力。每个值表示平均值±SEM（n = 4）* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001（与FLZJSF样品在0h组的比较）。 5 FLZJSF对H2O2胁迫下PC12细胞存活的影响 H2O2处理的细胞活力（300µM持续24h）与对照组相比降低了75％。如图3A所示，在四个发酵时间点终浓度为0.06mg / mL的FLZJSF样品对PC12细胞的细胞毒性作用不显着（p> 0.05）。同时，在发酵的0h, 4h和6h用FLZJSF样品预处理终浓度分别为0.01、0.03和0.06 mg / mL的PC12细胞，可显着提高细胞活力（p <0.05，如图3B所示），而FLZJSF样品在24h发酵后却能显着提高细胞活力。与H2O2处理组相比，三种不同的浓度没有引起任何显着的生存力变化（p> 0.05）。特别是FLZJSF样品在4h处的预处理将细胞活力提高到90-100％。另外，与H2O2组相比，对照组1中的细胞存活率没有显着差异。结果表明，FLZJSF样品中化合物的转化可阻止H2O2诱导PC12细胞的细胞毒性。 图3.FLZJSF对PC12细胞存活率和细胞内ROS和MDA水平的影响。（A）不同浓度的FLZJSF处理的PC12细胞的存活率。（B）用不同浓度的FLZJSF预处理2h然后连续2小时经H2O2处理的PC12细胞存活率。（C）通过荧光显微镜测量的细胞内ROS水平。（D）细胞内MDA水平。 6黄酮类化合物与抗氧化能力的相关性 采用最小二乘（PLS）模型确定了不同发酵时间（0、1、2、4、6、8、24和48h）FLZJSF中生物活性与化学成分之间的联系。数据集包括FLZJSF中9种化合物的含量，DPPH和O2-清除率。如图4A所示，PC2分别从2，4和6点与0、1、8、24和48h分离。O2-，FRAP和类黄酮苷元之间具有高度相关性。相反，FLZJSF样品包含糖苷类化合物quercetin-3-O-Rut，quercetin-3-Oβ-D-Gal，quercetin-3-O-Rob，kaempferol-3-O-Rut，quercetin-3-Rha和quercetin-3-O -β-D-Gluat，与生物活性呈负相关。此外，将FLZJSF样品在距抗氧化剂最远的8、24和48 h处进行了聚类。如图4B所示，在PC2细胞中H2O2诱导的抗氧化活性测试中也发现了类似结果。然而，FLZJSF样品中0的kaempferol-type和quercetin-type glycoside化合物中的高含量与FLZJSF样品中的酚酸相比，在化学上与第一组分的化学活性呈正相关，且与第一个组分的化学活性相反。 图4.PLS显示了在化学实验（A）和PC12细胞实验（B）中代谢产物变化与FLZJSF所对应样品抗氧化活性的相关性。 讨论 评论 在我国历史上，曲（酵母）经常被用到中药制作过程。此外，世界最早的青霉素-陈芥菜卤，也是使用发酵的手段处理制成的。可见发酵是一种处理植物或中药的有效手段。现代微生物学飞速发展，通过调控发酵过程中微生物群落迭代过程，有望开展新的研究领域，将中医进一步发扬光大。 原文网址：https:///10.1093/femsec/fiaa037
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