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编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 胰腺导管腺癌(PDAC)表现出很大的细胞异质性，具有明显的上皮癌和间质癌细胞群。然而，PDAC细胞多样性背后的细胞层次仍未知。在这里我们确定了跨膜四蛋白CD9作为PDAC肿瘤起始细胞的标记。CD9high细胞增加了类器官的形成能力，并在限定稀释的情况下产生体内肿瘤移植物。由CD9high细胞引发的肿瘤再现了原代PDAC的细胞异质性，而CD9low细胞仅产生导管样上皮子代。敲低CD9降低了PDAC类器官的生长，以及Pdx1-Cre、LSL-KRasG12D和p53F/F小鼠中杂合CD9的缺失延长了总生存期。从力学上看，CD9促进了谷氨酰胺转运蛋白ASCT2的质膜定位，增强PDAC细胞对谷氨酰胺的摄取。因此，我们的研究确定了一个能够启动PDAC并导致PDAC异质性的PDAC亚群，表明PDAC的细胞多样性是由PDAC干细胞分化产生的。 论文ID 实验设计 实验结果 1. PDAC中潜在TIC标志物的鉴定 以前，肿瘤启动细胞(TICs)是通过其正常组织干细胞对应物的标记来识别的，但是成人胰腺干细胞还没有明确的定义。为了丰富体内TIC功能，我们分析了肿瘤发生的早期阶段，发现肿瘤的很大一部分是由高致癌性细胞构成的。常用的小鼠PDAC模型在胚胎发育过程中诱导肿瘤发生，阻碍了我们对PDAC发生的分析。因此，我们使用LSL-KRasG12D；Fbw7F/F；Ck19-CreER；R26-LSL-YFP (KFCkY)模型，利用他莫昔芬处理后，在成年动物中触发PDAC快速发育(图1a)。 服用它莫西芬两周后，一些KFCkY导管细胞仍保持组织学正常，与CkY导管的细胞没有区别，但是其他细胞表现为细胞核增大，具有细胞转化的特征(图1b)。转化和无反应的导管均显示肿瘤诱导等位基因的重组，YFP表达突出，并通过基因分型PCR证实。服用他莫西芬4周后，我们仍然观察到无反应的YFP导管细胞(图1b)，表明不同的转化电位不是由异步重组引起的。 为了寻找转化细胞和无反应细胞之间的差异，我们分析了之前描述的CSC标记物。在转化细胞和无反应细胞中检测CD133的表达，排除了它作为一个特殊的TIC标记物。在他莫昔芬治疗两周后，CD44在转化的KFCkY导管细胞中表达，但在KRas和Fbw7等位基因完全重组的KFCkY导管细胞中没有表达(图1c,d)。在后期，几乎所有的肿瘤细胞(不仅是高致瘤潜力的细胞)都表达CD44(图1c)。然而，通过检测CD44的表达能将转化细胞从无反应细胞中甄别出来，为我们分离这两个细胞群提供了工具。 利用全基因组表达分析来自KFCkY小鼠的YFP+ CD44+和YFP+ CD44−胰腺细胞在最早阶段的转化(他莫昔芬治疗两周)，发现在转化的细胞群中多个基因过表达，在PDAC中上调，包括Epcam、Ctse15、Agr2和CD44，作为一个内部阳性对照(图1e,f)。在已建立的PDAC中，为了识别可能区分TICs的标记物，我们选择了在转化细胞中表达至少1.5倍，包含至少一个细胞外区域，而在正常胰腺中低表达，并且根据人类蛋白质图谱在PDAC细胞中表达的候选细胞。跨膜四蛋白CD9符合上述标准，通过RT-qPCR验证其在转化KFCkY细胞中过表达(图1g)。与CD44不同的是，在PDAC晚期，CD9的高表达仍然局限于KFCkY肿瘤细胞的一个亚群。 为了检测CD9在发育较好的PDAC中的表达，我们使用了LSL-KRasG12D、p53F/F、Pdx1-Cre、Rosa26-LSL-YFP (KPCY)模型(图1h)。虽然所有的PDAC细胞都表达CD9蛋白，但在晚期的PDAC中，约5%的YFP+肿瘤细胞亚群呈现CD9表面表达增加 (YFP+CD9高表达)。在KPCY和KFCkY模型中，CD9主要定位于质膜，具有富含跨膜四蛋白膜微区的点状染色特征。CD9的表面表达也被限制在KPCY肿瘤的一个细胞亚群中。 2. CD9蛋白表达标志着PDAC TICs 肿瘤样细胞器培养丰富胰腺干细胞样细胞，反映了肿瘤的起始特性。从新鲜组织分离的KPCY PDAC中分离出的YFP+CD9high细胞比YFP+CD9low细胞具有更高的组织形成能力(图2a,b)，该结果可以在导管KFCkY模型中复制，因此不依赖于p53或Fbw7。作为类器官培养几代后，CD9high群体保持更高的类器官形成能力(图2c)。 CSC是动态的，随肿瘤发展而变化。虽然CSCs和非CSCs都能在接种后存活，但CSCs在肿瘤开始时被富集，随后在肿瘤扩张时比例减少。根据TIC表型，CD9high肿瘤细胞在汇合时比例较低(约5%)，但在接种后，随着类器官的建立而增加，在4天后达到峰值(~50%)，随着培养密度的增加而恢复到基线水平。CD9high细胞阳性的细胞增殖标志物Ki67多于CD9low细胞，总体增殖在第4天最高。这些动态表明，尽管大多数肿瘤细胞接种的是CD9low，但是类器培养物由CD9high细胞启动和繁殖，然后再产生CD9low细胞。 为了评估CD9在体内标记PDAC TICs的能力，我们将CD9high和CD9low KPCY组织样细胞分选并皮下注射到免疫缺陷小鼠的对侧侧翼(Nu/Nu)，20万细胞连续稀释到200个细胞(图2d)。在所有稀释下，CD9high细胞都形成了肿瘤结节，都在CD9low细胞之前出现，表明CD9high肿瘤细胞在移植后更有能力引发肿瘤。 然而非TICs具有有限的增殖潜力，可以形成结节，TICs可以维持肿瘤的生长。即使限制细胞稀释的情况下，由CD9high细胞引发的肿瘤也会变得更大更快。相比之下，CD9low细胞在限制稀释时不能维持肿瘤生长，最初由200个细胞形成的4个结节中有2个完全消退(图2e,f)。此外，通过磷酸化组蛋白H3染色检测，CD9high肿瘤移植物比CD9low肿瘤移植物含有更多的增殖细胞(图2g)。 3. CD9高表达细胞再现原发性肿瘤异质性 正如KPC模型所述，KPCY肿瘤包含导管上皮(YFP+CK19+)和间充质(肉瘤样)形态(YFP+CK19−)(图3a顶部)。与原发肿瘤相似，移植的CD9high细胞形成的皮下肿瘤也具有混合组织学，包括导管样(CK19+)和梭形(CK19−)肿瘤细胞(图3a中部)。然而，来自CD9low细胞的肿瘤移植物形成了完全由CK19+立方上皮细胞组成的囊性结构，没有显示出纺锤状的肿瘤细胞(图3a底部)。 PDAC细胞的肉瘤样形态，在人类样本中也可以看到，通常认为是由于上皮-间充质转变，涉及到肿瘤的侵袭性和化疗耐药性。CD9high来源的肿瘤移植物与原代PDAC相同，同时含有上皮细胞(E-cadherin+)和间充质细胞(vimentin+)。相反，CD9low来源的肿瘤结节只包含E-cadherin+细胞，几乎没有vimentin+细胞，这与这些肿瘤中没有梭形细胞一致(图3b-e)。综上所述，这些数据表明CD9high KPCY肿瘤细胞能够有效地启动肿瘤的生长，从而再现原发性KPCY肿瘤的形态和细胞异质性。 4. CD9是PDAC快速发展所必需的 为了确定CD9在PDAC中是否具有重要功能，我们检测KPC类器官中的CD9水平。使用三种不同的慢病毒短发夹RNA(shRNAs)稳定敲低CD9，发现降低了器官形成能力(图4a,b)。当皮下注射到免疫缺陷小鼠侧翼时，CD9敲低细胞形成更小的肿瘤移植瘤，证实CD9的表达是肿瘤发生所必需的(图4c)。 构建CMV驱动的慢病毒EGFP- mCD9融合 (之前被证明可以维持CD9的功能)产生了EGFP和CD9蛋白的相同表达，并导致EGFP - mCD9定位于KPC细胞的质膜，而EGFP定位于细胞质。表达EGFP - mCD9的细胞，其CD9表达水平是内源性水平的4倍(图4d)，与EGFP对照细胞相比，KPC类器官形成能力增强(图4e)，这表明CD9丰度可能限制了肿瘤的起始。这些发现通过一个EF1α驱动的CD9过表达构建中得到证实。将EGFP - mCD9细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠的侧翼时，与EGFP对照细胞相比，可形成更大的肿瘤移植瘤(图4f)。 为了测试CD9在PDAC侵略性本地模型中的作用，我们将CD9等位基因插入KPCY背景中(图4g)。通过流式细胞术和RT-qPCR对原代胰腺样本进行检测，证实YFP+细胞中CD9完全缺失。值得注意的是，胰腺中杂合CD9缺失显著延长了含有纯合或杂合缺失p53的KPCY小鼠的寿命，这表明CD9参与了PDAC在体内的进展(图4h,i)。在p53杂合KPCY模型8周时，CD9WT/WT小鼠的肿瘤已经发展为PDAC，而在CD9杂合或纯合小鼠中肿瘤仅达到PanIN (胰腺上皮内瘤变)阶段。令人惊讶的是，纯合CD9缺失并没有延长寿命，与CD9杂合小鼠相比，在8周时胰腺病变更严重(图4h,i)。我们假设在胚胎发生过程中完全删除CD9激活代偿机制，而杂合缺失则不会。根据这一假设，KPC CD9Δ/Δ细胞比CD9Δ/ WT细胞更有效地形成皮下肿瘤移植瘤。CD9杂合KPC小鼠肿瘤进展的减缓和存活率的增加与CD9敲除后观察到的TIC特性的降低是一致的。总的来说，这些实验表明，除了在PDAC中标记TICs之外，CD9还在体外驱动类器官的形成，并在体内参与PDAC肿瘤的形成。 图4 CD9是PDAC快速发展所必需的 5. CD9促进谷氨酰胺转入TICs 作为跨膜四蛋白家族的成员，CD9之前被描述为一种支架蛋白，与多种其他细胞表面蛋白相互作用，包括PTGFRN、EpCAM和其他跨膜四蛋白，包括CD9本身和CD81。由于CD9功能高度依赖于上下游蛋白，我们在KPC细胞中使用免疫沉淀-质谱(MS)方法来发现PDAC中相关的CD9相互作用蛋白，并研究CD9如何参与TIC功能。根据EGFP和EGFP - mCD9结合蛋白的强度绝对定量(iBAQ)，CD9是EGFP - mCD9条件下最富集的蛋白，而PTGFRN和EpCAM被确定为相互作用蛋白(图5a)。其中，谷氨酰胺转运蛋白ASCT2(由Slc1a5编码)和乳酸转运蛋白MCT1(由Slc16a1编码)被发现最多，这两种转运蛋白均未与跨膜四蛋白相互作用(图5a)。免疫共沉淀证实了CD9与ASCT2和MCT1的相互作用(图5b)。由于有报道称ASCT2和MCT1与同样含有EpCAM的蛋白复合物(图5c)相关，我们测试了CD9细胞表面表达是否与这些蛋白的表达相关。事实上，与CD9low细胞相比，CD9high细胞的EpCAM、basigin (MCT1伴侣)和CD98hc(氨基酸转运蛋白LAT1的结合伙伴)表面水平也更高。 鉴于KRas驱动的胰腺癌依赖谷氨酰胺代谢，我们重点研究了ASCT2和CD9之间的相互作用。ASCT2定位于KPC类器官细胞质膜上富含CD9的斑点。CD9high细胞膜tdTomato染色的ASCT2共定位在类细胞器培养高于CD9low细胞的。为了检测CD9缺失对ASCT2的影响，我们采用了双重组酶系统(图5d)，允许CD9在已建立的肿瘤组织中被急性删除。在该系统中，PDAC通过使用Pdx1-Flp重组酶激活胚胎KRasG12D和p53缺失启动，然后使用腺病毒Cre或4-羟基他莫西芬(4-OHT)在肿瘤组织中删除CD9。当CD9基因在生长的KPF-CD9类器官中被严重删除时，ASCT2也将其膜定位转移到整个细胞的更扩散的染色模式(图5e)，使用细胞分割算法进行量化(图5f)。在胰腺癌患者中，高表达的ASCT2与较差的预后有关，这表明控制ASCT2的定位可能有助于CD9在PDAC中的功能。根据这一观点，与CK19+无反应的导管细胞相比，在转化CK19+的肿瘤细胞上，以及在KFCkY模型的转化YFP+CD44+病变上，ASCT2上调。由于ASCT2是胰腺癌细胞中重要的谷氨酰胺物质，我们分析了KPF-CD9类器官中的谷氨酰胺摄取。与对照细胞(KPF-CD9F/WT)相比，急性CD9的一个等位基因的基因失活(KPF-CD9Δ/WT)显著降低谷氨酰胺吸收和胞内谷氨酰胺丰度以及降低13C-谷氨酰胺克雷布斯循环的代谢产物(图5g)。KPF-CD9Δ/WT细胞中这个缺陷不是因为整体代谢物丰度的减少，其他代谢物在这两种条件下也是同样的丰度。 为了确定CD9缺陷的肿瘤细胞中谷氨酰胺摄取减少是否会影响其肿瘤起始，我们测定了对谷氨酰胺可用性调节或ASCT2过表达对类器官形成的影响。正如所料，KPF-CD9Δ/WT类器官中显示减少了类器官形成中含谷氨酰胺的基础水平。重要的是，这种表型可以通过补充谷氨酰胺或通过ASCT2过表达来改善(图5h)。在CD9low KPC细胞中，过表达ASCT2也增加了类器官的形成(图5i)，说明CD9在PDAC TICs中的关键功能是促进谷氨酰胺摄取。通过谷氨酰胺酶抑制剂治疗限制谷氨酰胺代谢已被提出作为PDAC和ASCT2抑制剂的潜在治疗策略。PDAC类器官中急性CD9缺失增加了对谷氨酰胺酶和ASCT2抑制剂的反应(图5j)，提示CD9和谷氨酰胺代谢联合靶向可能是一种有价值的治疗策略。 由于CD9对PDAC中谷氨酰胺吸收的影响，我们测试是否KPC CD9Δ/Δ肿瘤通过改变他们的新陈代谢来弥补CD9的损失，鉴于纯合子CD9缺失没有提供一种生存受益。我们分析了KPC(p53Δ/Δ)老鼠的胰腺组织在四个星期时的总代谢物，无论CD9处于任何状态，都已发展成PDAC。LC-MS检测和方差分析的前100种代谢物的无监督聚类分析显著改变代谢特性，表明CD9WT/WT和CD9Δ/Δ组织聚类在一起，而与CD9Δ/WT组织分开(图5k)。鉴定出的代谢产物可分为几种代谢途径，包括谷氨酰胺/谷氨酸代谢和相关途径。引人注目的是，CD9WT/WT和CD9Δ/Δ组织含有的谷氨酰胺水平高于CD9Δ/WT组织(图5k)。此外，Slc1a5基因编码ASCT2在CD9Δ/Δ细胞中上调，而其他跨膜四蛋白未被上调。因此，KPC CD9Δ/Δ肿瘤中CD9完全失活会导致补偿代谢重新布线，致使肿瘤快速发展。 6. CD9表达与患者较差的预后相关 为了确定CD9是否也是人类PDAC中的功能性TIC标记物，我们首先分析了公共数据库。高CD9信使RNA表达与较短的总生存期相关(n= 179，Cancer Genome Atlas dataset，图6a)；在微解剖的人类PDAC样本中，约有10%显示出CD9的基因组扩增(UTSW数据库，图6b)。CD9与人PDAC常见扩增的KRAS基因一起位于12号染色体的短臂上。然而，我们观察到KRAS和CD9很少同时扩增，这表明CD9扩增不是一个同步事件，可能单独驱动人PDAC(图6b)。另一些样本，主要是那些没有CD9扩增的样本，显示了SLC1A5的扩增(图6c)。我们还证实了CD9与ASCT2在人胰腺癌细胞PANC-1中的相互作用。 此外，切除的人PDAC肿瘤显示CD9high细胞亚群(图6d)，细胞表面也显示高水平的ASCT2。因此，CD9介导ASCT2调节在人PDAC中也可能发挥重要作用。大量CD9high细胞为CD44low和CD133low，表明CD9标记了部分重叠的群体，但与之前描述的CSC群体不同。重要的是，与CD9low细胞相比，从人PDAC类细胞器培养中分离出来的CD9high细胞(KRAS突变体)形成了更多的类细胞器(图6e)，这表明，在小鼠中，人CD9high细胞增强了肿瘤起始特性。 图6 CD9在人PDAC中的表达及CD9在PDAC中的作用模型 讨论 在试图定义和理解TICs在PDAC中的生物学特性时，我们利用肿瘤发生早期时肿瘤起始能力的异质性来识别TICs中CD9的上调。CD9high细胞，而非CD9low细胞，产生异质和高增殖的肿瘤，组织学上类似于原发的PDAC。PDAC类器官中CD9水平的改变影响了它们的肿瘤起始能力，而在PDAC自身模型中杂合缺失CD9增加了小鼠的总生存率。机制上，CD9通过与谷氨酰胺转运体ASCT2相互作用并增强谷氨酰胺摄取，与肿瘤细胞代谢改变相关联。因此，我们确定CD9是PDAC中具有重要功能的TICs标记物(图6f)。 虽然一些CSC标记已经被提出用于PDAC，包括CD44、c-Met和CD133，以及自身荧光/ABCG2表达和ALDH1活性，但这些标志物在公认的TIC人群中的功能相关性和重叠仍存在争议。然而，CD9的细胞表面定位，以及它与TIC代谢的功能联系，使其成为TIC生物学的标志物，以及基于抗体的治疗的潜在靶点。从最近发现TSPAN-1作为地中海三肠虫的全能成体干细胞的标记，到Tspan3作为小鼠白血病起始细胞的标记，越来越多的证据暗示了跨膜四蛋白在干细胞中的重要性。 CD9之前被描述为具有促进肿瘤和抗肿瘤的功能，包括抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、前列腺癌转移和胰腺癌细胞系表面EGFR表达。然而，为了支持我们的发现，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中CD9表达增加。CD9也被描述为胶质母细胞瘤和B细胞急性淋巴细胞白血病CSCs的标记物。我们的数据表明CD9high细胞可以启动并维持CD9蛋白本身在PDAC中的重要作用。 由于CD9的过表达增强了类器官和肿瘤的形成，CD9水平可能限制了PDAC细胞在肿瘤发生过程中的速率。谷氨酰胺是人类PDAC肿瘤中代谢率最高的氨基酸。在PDAC进展过程中，血清谷氨酰胺水平下降，而谷氨酰胺代谢在KRas驱动的PDAC中至关重要。由于PDAC微环境灌注不良且营养不良，导致PDAC细胞使用谷氨酰胺转运体和大胞饮来摄取谷氨酰胺。我们的数据表明，TICs有一种机制而最大限度地吸收谷氨酰胺。我们推测，由于CD9high TICs表面高水平的ASCT2和谷氨酰胺代谢，使得它们对谷氨酰胺酶和ASCT2抑制的敏感性降低。KPC肿瘤在谷氨酰胺酶抑制剂存在的情况下已经被证明会继续生长和代谢重组。鉴于CD9杂合性可显著延长KPC小鼠的寿命，对CD9功能的部分干扰可能足以获得治疗效果。另外，同时靶向CD9和谷氨酰胺代谢可以预测潜在的代偿机制并改善长期反应。综上所述，我们的发现为通过CD9靶向TICs抑制PDAC生长开辟了几种可能的途径。 |
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