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编译：枫叶，编辑：小白、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 疱疹病毒（herpes virus, HHV）是一类有包膜的DNA病毒，其感染宿主广泛，主要侵害皮肤、黏膜以及神经组织，其编码保守的蛋白激酶（CHPK）能够在感染过程中激活磷酸化敏感过程。然而，人们对CHPK与细胞因子结合以及如何影响其调节功能的研究较少。在本研究中，作者通过定量蛋白质组学技术鉴定了人类疱疹病毒（HHV）CHPK的细胞互作因子，发现CHPKs可以靶向转录和复制的关键调控因子。β-疱疹病毒激酶能够与细胞周期蛋白(Cyclin)A及其相关因子相互作用，CHPK非催化N末端的核定位信号（NLS）及与其重叠的RXL基序在这种互作中发挥重要作用。Cyclin A的结合可抑制NLS功能，从而实现CHPK亚细胞定位和磷酸化状态的动态变化。巨细胞病毒激酶M97将cyclin A隔离在细胞质中，这对病毒抑制细胞DNA的复制至关重要。概括来说，本研究主要揭示了细胞周期蛋白和病毒激酶之间重要的生理互作关系及其微调控功能。 论文ID 实验设计 实验结果 1. CHPKs以细胞转录和复制的关键因子为靶标 为了鉴定CHPK的互作因子，作者用HA标记了七种不同的人类疱疹病毒的CHPK，并用这些病毒和空载体同时转染轻重氨基酸的稳定同位素（SILAC）标记的HEK-293T细胞，随后对样品进行了HA亲和纯化（HA-AP）和蛋白质组学分析（图1a）。结果表明样品的SILAC倍数变化具有良好的可重复性，作者设置了SILAC倍数变化的显著性水平参数（图1b)以区分互作因子与背景结合剂。为了确定激酶共有的、类群特有的（例如α, β, 或γ-类）或独有的激酶的互作因子，作者将所有测试的激酶的SILAC倍数变化进行聚类分析（图1c），发现包含TCP1的伴侣蛋白和激酶成熟复合物（CDC37，HSP90）可与所有分析的激酶共同纯化，且所有人类β-疱疹病毒CHPKs均与S/G2期特异性Cyclin（CCNA2、CCNB1）、CDK（CDK1、CDK2）共纯化（图1d），说明CHPKs能够与这些蛋白互作来介导细胞激酶的折叠和成熟，这些互作能够通过反向免疫共沉淀（Co-IP）验证。Co-IP还发现了前者与MuHV-1的同源M97激酶（MCMV）的互作（图1e）。对亲和纯化的样品进行蛋白质组学分析和免疫共沉淀验证的结果相互印证，共同说明这些在细胞复制和转录中发挥关键功能的因子与CHPK互作以发挥下游调控作用。 图1 细胞复制和转录的关键调控因子是CHPKs的靶标 a：实验流程示意图。用HA标记的人类疱疹病毒激酶或空载体对照转染轻重SILAC标记的HEK-293T细胞（n=3）。样品经抗HA亲和纯化后，再进行质谱分析；b：互作因子筛选。根据三个重复的t检验P值和SILAC比率的平均值，将候选互作因子与背景结合剂进行区分。P值=0.05，倍数变化值FDR=1%。HHV6-U69激酶在火山图中被标示；c：激酶互作因子的交叉对比。比较所有候选的互作因子在α、β、和γ-HHVs激酶中的共富集。对富集谱进行聚类分析并进行GO富集分析；d：Cyclin-CDK复合物与β-疱疹病毒激酶共同纯化。图片描述了在指定激酶的AP-MS样品中，靶蛋白CDK1，CCNB1，CCNA2和CDK2在单个重复样本中的SILAC比率（n = 3）；e：Cyclin A–CDK与β-疱疹病毒激酶的结合的验证。将转染的293T细胞的全细胞提取物进行Cyclin A共沉淀处理，并通过免疫印迹验证Cyclin A与CDK2和HA标记激酶的互作；f：人和啮齿类β-疱疹病毒激酶中假定的cyclin A结合位点的比对。图中碱性残基标记为蓝色，粉红色为疏水残基；g：人疱疹病毒激酶的示意图。图中显示的是保守性较低的蛋白质N端催化结构域的位置以及RXL/Cy基序（粉红色）和预测或实验验证的核定位信号（NLS）（灰色）的相对位置。 2. β-疱疹病毒激酶通过NLS-RXL模体与cyclin-CDKs结合 氨基酸序列分析发现能够直接与Cyclin互作的CDK的大部分残基在β-HHV激酶中并不存在，取而代之的是在N末端非催化部分中的RXL/Cy基序（图1f-g），该基序能够招募cyclin和CDKs的底物和抑制因子。NLS序列的C末端部分与RXL基序的N末端部分重叠（图2a）。因此，在研究U69和M97中的RXL基序在与cyclin A结合中的作用时，必须考虑到RXL突变可能会对NLS功能产生负面影响。为此，作者分别突变了RXL基序的核心（RXL->AXA）和疏水性部分（LF->AA，LXF->AXA），从而构建了每个激酶的两种突变体，两种突变都使得M97和U69激酶无法与cyclin A结合（图2b）。将包含M97和U69激酶NLS和RXL重叠元素的32-37个氨基酸片段克隆到pHM830质粒中构建报告基因表达载体（图2c），发现当插入了野生型（WT）NLS-RXL区域的表达载体转染细胞时，胞质GFP信号出现核转移（图2d，e），表明NLS能够正常发挥功能；RXL->AXA突变则削弱了HHV6U69中的这种功能，甚至破坏了该基序在M97中的活性。然而，当只有RXL/Cy基序的疏水残基发生突变时，NLS功能并未被影响（图2d，e）。这些结果表明，cyclin结合域和NLS序列被整合到一个复合基序中，可以通过构造突变干扰该基序两种功能中的任意一种，这为接下来的验证创造了基础。 3. M97在感染细胞中组装cyclin-CDK复合物 为了分析感染系统中NLS-RXL模块的特征和作用，作者使用SILAC和AP-MS评估了M97互作因子的互作时相。在感染早期（12h），M97互作蛋白几乎完全由cyclin、CDK和相关蛋白组成。在感染晚期（36h），其他细胞和病毒因子与M97共同纯化，包括M50-M53（MCMV37的核出口复合体）和Lin54（细胞周期调控的DNA结合亚基MuvB复合物，受pUL97调控）说明M97在细胞周期调节、病毒逸出和基因表达调控中起作用。 在整个感染过程中，M97都与Cyclin A/B-CDK复合物存在相互作用（图3a）。在HA-M97质谱样品中，Cyclin A–CDK2的分子量与M97本身的分子量相似，表明其在受感染的细胞中发生了强烈的化学计量相互作用。RXL/Cy基序的突变破坏了cyclin A与M97的互作（图3c，d）。但是，这些突变并不能影响cyclin A的蛋白水平（图3b）或cyclin A相关激酶活性（图3f）。此外，与“激酶致死”的K290Q突变不同，RXL/Cy突变不会损害M97的水平和活性（图3b，e）。因此，M97–CyclinA的结合对所涉及的互作蛋白的丰度和酶活性没有影响。这表明β-疱疹病毒CHPK是细胞周期蛋白非依赖性激酶。 4. 细胞周期蛋白的结合控制M97的亚细胞定位 使用免疫荧光显微镜观察发现，在感染后8h，M97-WT定位于细胞核（图4a），此时cyclinA含量很低。而当感染后24h和48h，M97-WT就会重新分布到细胞质中（图4a，左中列），此时的cyclin A水平已经较高。因此，M97在细胞质中的定位与cyclin A蛋白水平的提高有关。作者随后分析了RXL/NLS模块在M97亚细胞定位随时间变化过程中产生的影响。当NLS的功能被R45A/L47A突变破坏后，M97在整个感染过程中都被限制在细胞质中（图4a，b，中右栏）。相比之下，当NLS-RXL模块中的NLS部分被完整保留，仅阻止细胞周期蛋白结合时（L47A / F49A），M97呈现核定位模式（图4a，b，右栏）。这说明cyclin A的结合与M97的感染后期的重新定位有关。 随后，作者分析了与已知v-CDK目标基序匹配的磷酸位点，如pSP、pSXXK、LXpSP（p表示磷酸化残基）。当细胞被M97R45A/L47A突变株感染时，细胞质中pS/TP和pSXXK位点比细胞核中相应位点磷酸化程度显著提高（图4c）。而当细胞被M97L47A/F49A突变株感染时，核蛋白的磷酸化更强。这些数据共同表明，cyclin A的结合使M97的蛋白修饰和亚细胞定位发生变化。 a：用MCMV-HA-M97突变株感染无血清培养基培养的3T3成纤维细胞。感染后第8h、24h和48h，通过共聚焦免疫荧光显微镜检查细胞的HA-M97亚细胞定位（绿色），细胞核用DAPI复染，比例尺：10μm；b：不同HA-M97亚细胞定位的细胞比例；c：NLS-RXL/Cy缺陷的M97R45A/L47A或RXL/Cy缺陷的M97L47A/F49A病毒感染SILAC标记的无血清培养基培养的3T3细胞。感染后24小时，收集细胞并进行磷酸化蛋白质组分析。用两组被感染细胞的SILAC log2倍数变化描述属于具有核，细胞质或未分类亚细胞GO注释的蛋白质的磷酸位点箱形图。pSP，pSXXK，LXpSP和所有其他位点被单独评估。中心线：中位数；箱体：上下四分位数；边缘：1.5×四分位间距；异常值（边缘外部的数据点）已删除以提高可视性。P值基于单侧Wilcoxon秩和检验（n=2）。 5. M97通过cyclinA的结合抑制宿主DNA的合成 图5 M97通过cyclin A结合关闭宿主DNA合成 用重组病毒感染无血清培养基培养的3T3细胞，并进行亚细胞分级分离（a），细胞周期分析（b，c）和共聚焦显微镜观察（d）。a.感染后24h，通过免疫印迹测定细胞核和细胞质组分中Cyclin A，E和CDK2的蛋白水平。以可溶性病毒核蛋白IE1和胞质标记GAPDH为对照（n=3）。b，c.通过碘化丙啶染色并用流式细胞术分析感染细胞的DNA含量，并绘制为DNA直方图。b.在感染的整个过程中监测病毒和细胞DNA的积累。c.为了区分病毒与细胞DNA复制，用更昔洛韦（GCV）处理感染的细胞。d，e.在30 hpi时，用EdU脉冲标记感染的细胞。通过EdU染色确定细胞和病毒DNA的合成位点。EdU与病毒DNA合成位点的病毒复制因子M57的荧光（红色）重合。DAPI用于核染色（蓝色荧光）。比例尺：10μm。e.根据细胞内EdU和M57荧光的定位，统计各种细胞占比。f.感染重组病毒（MOI = 0.02）的小鼠胚胎成纤维细胞。在感染后不同时间，收集上清液并测定病毒滴度。 讨论 本文作者通过CHPK互作组的比较分析发现了宿主蛋白的互作特征，而这些特征具有CHPK种类特异性（图1c）。β-疱疹病毒-CHPKs与cyclin A的互作导致细胞周期调节因子的高阶复合物形成（图3），这种互作能够影响CHPK和cyclin A的功能。MCMV能够使CHPK的亚细胞重新定位（图4a）从而改变其作用底物（图4b）。此外，这种互作还能改变cyclin A的核质定位从而有利于病毒阻止宿主的DNA复制（图5）。 V-CDK是CHPK的一部分，V-CDK具有宿主不具备的序列特征，可以受细胞因子（例如CAK，CKI和cyclins17）的控制。本研究表明一些v-CDK获得了RXL基序（图1），这些基序可以调控cyclin A和v-CDK的互作，其特征是一方面依赖于细胞周期对病毒激酶的调节（图4），另一方面能够结合cyclin A以调控其功能（图5）。v-CDK-Cyclin A互作可使β疱疹病毒激酶（如M97）激活S/G2代谢，同时抑制细胞DNA合成（图5）。 复合NLS-RXL/Cy元件在宿主细胞周期的许多关键调节蛋白中均存在。细胞周期蛋白与该元件的结合对于它们的细胞周期依赖性定位可能是必不可少的。但同样存在例外，例如CDC6的RXL基序与NLS相邻但不重叠，这时，cyclin A募集CDK以通过磷酸化作用中和NLS。 除了具有重要功能的β疱疹病毒激酶与Cyclin/CDK的互作外，本研究的蛋白质组学分析结果还表明CHPK与更多的细胞蛋白相互作用（图1c）。许多CHPK互作因子在功能上与DNA修复和细胞周期调控有关。同时，CHPKs还与多种转录阻遏复合物存在相互作用。例如，pUL97与TRIM28-ZNF复合物互作（图1c），或者可根据TRIM28的磷酸化状态沉默干细胞中CMV基因的表达。此外，pUL97可与PHC2，RING1，CBX4和BMI1共纯化（图1c），后者形成的复合物与HCMV复制的调控有关。研究还发现BGLF4与HIRA组蛋白伴侣复合物（HIRA，CABIN1和UBN2）的核心亚基存在互作，该复合物通过将组蛋白H3.3沉积在疱疹病毒基因组上来限制病毒感染。总之，这些数据表明CHPKs可以控制宿主调节病毒转录或复制的系统，从而操控自身的感染进程。 此外，本研究的互作组分析还表明，CHPKs能够以参与宿主复制、DNA修复和转录的主要调控因子为靶标，遗憾的是，这些实验无法解决依赖于被感染环境的蛋白质互作问题。例如，与感染的细胞相比，CHPKs在转染条件下的丰度、修饰、折叠或定位均存在差异。因此，依然需要运用激酶更广泛的相关功能（在感染过程中动态变化）来解释我们的发现。例如，clclin A的相互作用有助于激酶在感染的特定阶段发挥功能，在感染早期M97位于核内时，M97激酶可以在早期维持核蛋白SAMHD1的磷酸化（图4a）。而在感染后期，核层被局部分解，病毒向细胞质逸出，病毒从核内复制到胞质内装配的转变会伴随着病毒激酶的同时重新定位这一现象的机理仍有待进一步探索。 a：NLS-RXL/Cy模块在感染细胞中功能的概括模型。 在没有cyclin A（早期G0/G1）的情况下，M97的NLS起作用，M97被引导进入细胞核，MCMV诱导cyclinA，并驱动细胞进入S期环境（G1/S，晚期），Cyclin A与M97上的RXL/Cy基序结合并掩盖NLS，导致M97–cyclin A复合物积累在细胞质中。细胞DNA的合成由于cyclin A的定位错误而受到抑制；b：RXL/Cy-NLS模块在几种细胞的细胞周期调节蛋白中具有保守性。 |
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