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编译：晨晨，编辑：Tracy、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 与土壤和堆肥中塑料的降解研究相比，海洋微生物降解合成聚合物的研究较少。本文使用宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学对海洋微生物菌群降解芳香族-脂肪族共聚酯进行了研究，该菌群能利用塑料薄膜作为唯一碳源，在15天左右得到二氧化碳最大转化量和生物量。该菌群还能协同降解聚合物，不同的微生物执行不同的降解步骤。研究人员鉴定了六种假定的类PETase酶和四种假定的类MHETase酶，它们分别具有降解脂肪族聚合物及其产物的潜能。研究结果表明，尽管多个基因和多种微生物具有执行每个降解步骤的潜力，但只有少数在生物降解过程中起作用。 论文ID 实验设计 1. 菌群富集：将1 g沉积物和10 ml海水样品混合，涡旋2分钟并让其沉降。用1 ml上清液接种每个培养物。观察到膜裂解后(约两个月)，将1 ml液体培养物转移到含有10 mgPF的新鲜ASW培养基中，但不添加胰蛋白胨。经过四次转移，获得了一种能够在六天时间内分解塑料薄膜的富集培养物，命名为I1菌群。 2. 细菌生长和CO2测定：TOC-L分析仪测定CO2生成量，细菌形态观察：场发射扫描电子显微镜（FESEM） 3. PF降解物的测定（FTIR）+产物测定（GC-MS）；宏基因组分析（Illumina NovaSeq 6000）+宏转录组分析（Illumina NovaSeq 6000）+宏蛋白组分析（LC-MS/MS）. 实验结果 以PF(己二酸丁二醇酯-共-对苯二甲酸酯)膜为唯一碳源的人工海洋培养基中富集了一个海洋微生物群落（命名为I1培养物）。为了阐明在PF生物降解中起作用的微生物和基因，我们进行了三个独立的实验（图1）：实验一旨在检测生物降解产物和微生物产生的二氧化碳(a)。实验二旨在通过宏组学分析生物膜附着细菌和游离细菌之间的差异(b)。实验三通过宏组学鉴定生物降解PF所需的基因和蛋白(c)。 为确保完全降解，试验进行了30天 (图1a)，在六天后我们目测到PF的分解。在一个月内，菌群将薄膜中约60%初始碳含量(图2a (a1，a2，a3))转化为CO2；在第6天到第10天(11-16%矿化/天)，降解率最高，15天后达到平稳。虽然薄膜的大部分似乎被分解了，但在培养物中仍有一些固体残留物。 我们进一步分析了PF寡聚物和单体以及完全矿化后固体残留物的组成。在PF中培养8天和20天后，我们从细胞和无细胞培养上清液中提取代谢物：培养8天后，细胞含有少量Ad、Se和Te单体，以及单酯BTe；20天后，细胞内Ad和Te的量减少了95%，Se和BTe的含量低于检测限，我们在胞外未检测到单体和寡聚体。同时，我们对PF降解后的固体残余物进行FTIR分析，并与不加入I1菌群的塑料样品进行比较。我们观察到在大多数生物样品中1710–1750cm-1的PF的主酯峰完全消失，在所有样品中检测到对应于固体碳酸钙矿物填料的峰和可能是生物膜组分的峰，而不添加I1培养物的塑料样品在30天后没有显示出任何FTIR变化。因此，剩余的固体残留物是附有生物膜的碳酸钙矿物填料，几乎所有的聚酯被降解。 接着我们分析了PF解体前菌群的生物膜形成能力。扫描电子显微镜(SEM)成像显示PF表面在三天后已被I1群落定殖(图2b)，在酚醛树脂表面均匀分布着由微生物活动形成的凹坑；六天后，形成了更大的洞和陨石坑，被胞外多糖包围的微生物生物膜位于这些孔中，而微生物主要是2 μm左右的杆状细胞，此时膜非常脆弱，开始解体。 除了膜本身的矿化之外，我们还单独测量每种单体的矿化。硼、碲、硒和铝酸向CO2的最大转化率分别为50%、59%、29%和40%；二氧化碳产量在10天后达到平稳。 图1 实验装置 (a)通过测量PF存在下的CO2产量来分析塑料碳的使用，(b)在PF附着(F)和自由生活细菌（S）的生物膜的不同，(c)PF存在时不同时间点 (t0，t1，t2，t3)的基因表达和蛋白质生物合成。a、b、c实验彼此独立进行，每个实验由三个生物学重复。 图2 PF上的微生物生长 a. I1菌群对PF膜的矿化和CO2的产生。显示了三个独立的生物学重复(a1、a2、a3)。b. 对照组(1a，2a)的扫描电镜图像，三天后(1b，2b)和六天后(1c，2c)生物膜形成和塑料降解。 生物信息学分析表明，I1是一个多样化的群落，主要由α变形菌、γ变形菌和黄杆菌以及数量较少的放线菌组成。实验中菌群组成丰度分布保持稳定(图3a)，而最丰富的六个箱中，有三个属于红细菌科，即17箱、20箱(假海洋细菌属)、10箱(未分类的红细菌科)、海洋杆菌(32箱)、水母科(bin 1箱)和海洋弧菌科(3箱)。这些约占总箱的80%。 塑料表面生物膜的微生物菌群组成与游离菌群组成形成对比(图1b所示的实验装置)。与膜附着菌群(图3a)相比，游离菌群中α变形菌(2，13，14，17，18，23，26，27箱)菌株和一些拟杆菌(1，30箱)、放线菌(6箱)和γ变形菌(12箱)菌株的相对丰度增加，而γ变形菌的海洋杆菌(32箱)和海洋骆驼科(28箱)，拟杆菌Geldibacter sp .(16箱)、嗜酸微生物细菌(4箱)、藻类(5箱)、属于海洋弧菌科的α变形菌(3箱)在膜附着菌群中富集生物膜类群(3、5、16、28、32箱)的丰度显著正相关；游离菌群(1，2，9，10，12，13，14，15，17，21，23，26，30，33)的丰度彼此正相关；与膜相关的箱的丰度与大多数游离菌群类群的丰度负相关(图3b)。 总的来说，在膜和游离菌群中四个最丰富的箱占总箱数的75-80%。当单体替代PF作为唯一碳源时，这种情况发生了变化。B作为唯一的碳源时，海洋杆菌(7箱)是最丰富的细菌，占群落的80%；糖杆菌属(12箱)在含Te的培养物中占主导地位，占箱群落的80%；以PF为碳源时，两种细菌含量都较低(≤2%)；Ad和Se的加入引发了多种细菌的生长，其中第1、13和32箱的细菌数量最多，占两种情况下群落的65%；而当单一单体作为碳源时，几乎检测不到在整个时间曲线和游离菌群中含量最多的第10和第17箱。 图3 箱谱图 丰度通过每个箱的匹配读数来计算。百分比丰度是根据每个宏基因组的匹配读取数计算的。a在不同时间点(t0，t1，t2，t3)的 PF膜附着细胞(F)和游离细胞(S)的分类丰度。气泡的大小代表了I1菌群中每个箱的平均相对丰度。每个气泡的颜色代表一个分类群。游离菌群和附着于膜上的细菌分别用紫色和红色表示。b膜附着细菌和游离细菌的丰度百分比之间的相关性。负相关以蓝色阴影表示，正相关以红色阴影表示。 3. 假定的PF解聚酶的基因组 宏基因组功能分析聚合物降解相关的基因，有六个Ples：分别是三种已知的PETases (Ples)、IsPETase、叶堆肥角质酶(AEV 21261.1)和嗜热双歧杆菌角质酶(adv 92528.1) (表1)。除了Ple453与已知的PETases有29-32%的一致性之外，这些Ples与已知的PETases有45-50%的氨基酸一致性(表1)。 表1 PF降解基因的鉴定 Ples都含有脂肪酶或酯酶的共有基序G-X1-S-X2-G，即酯酶催化三联体His237、Ser160和Asp206，属于α/β水解酶，都含有信号肽，通过Sec途径定位在细胞周质。与白热双歧杆菌AHK119的串联角质酶基因est1和est119相似，Ple200、Ple201、Ple628和Ple629的编码基因具有串联结构。这两种情况下，基因被359个核苷酸(nt)分开，中间没有ORFs。每个串联对的基因间具有不同的序列，二者都含有转录终止位点，表明基因可以独立转录。Ple200和Ple628之间、Ple201和Ple629之间的氨基酸同一性分别为90%，每个串联对之间的氨基酸一致性为74-75%，大多数Ples与另外两个海洋杆菌物种的相关基因聚在一起，Ple453与这些基因以及已知的PETases亲缘关系较远。 除了Ples之外，宏基因组中还有4个编码MHETase酶(Mles)的基因(表1)。它们与阪崎肠杆菌MHETase(A0A0K8P8E7)具有29-47%的氨基酸一致性，并且含有MHETase催化三体。与Ples相同，Mles携带一个Sec信号肽，其中三个是Mle800、Mle267和Mle288(表1)，Mle267和Mle800有60%的aa同一性。然而，它们与Mle046和Mle288的亲缘关系较远。 第四个Mle是Mle046，与IsMHETase的一致性最高(表1)。mle046与Celeribacter manganoxidans的质粒pDY25-B上的同源物有100%的一致性(CP021406.1)，在I1宏基因组中，mle046位于未分箱的107 kbp重叠群(重叠群279)上。这个重叠群还携带一个接合相关操纵子，可能属于接合质粒，该操纵子与来自海洋α变形菌的几个接合质粒的操纵子密切相关(> 90%)，如pDY25-B (92% nt一致性)。在pDY25-B上，mle046同源基因和另外八个ORF的两侧各有一个Tn7转座酶，形成一个假定的复合转座子。mle046位于重叠群279的末端，右侧还有一个Tn7型转座酶，该重叠群缺少pDY25-B转座子上的两个左侧开放阅读框和转座酶，该转座子的其余部分与pDY25-B转座子几乎相同(99%一致性)，因此，未分箱Mle可能位于α变形菌结合质粒上并通过转座子获得，目前没有证据表明其他Mles是通过水平基因转移而获得。 在I1宏基因组中我们发现了两个不同的TPD簇(表1)。它们位于12箱(命名为sTPD)，以及未分箱的21kbp的重叠群1092(为pTPD)。这两个簇与来自Comamonas sp . E6和I. sakaiensis18的簇是直系同源的(表1)。pTPD簇缺乏对苯二甲酸渗透酶基因tPhc，该基因存在于Comamonas和Ideonella中；在I1宏基因组中不存在tphC的同源基因。pTPD簇与pTy25-B上的TPD簇有100%的nt一致性；重叠群1092携带一个质粒分配蛋白parA的基因，与豆状芽胞杆菌质粒pP18i (CP010724.1)上的ParA有85%的一致性。pTPD簇的基因组信息表明，pTPD簇可能是α变形菌质粒的一部分，sTPD簇的结构与Comamonas和Ideonella不同，它只包含tphA2A3B基因，缺少还原酶基因tphA1(表1)，在sTPD基因附近，存在pht2345基因的同源物。尽管缺少tphA1，当Te为唯一的碳源时，12箱的丰度表明该生物体可以使用Te作为碳源，而来自I1的TphA2亚基形成三个不同的分支:pTphA2 (Tpad1092)、sTphA2 (Tpad12)和Ideonella/Comamonas TphA2。 PCA转化为丙酮酸和草酰乙酸由PCA4，5-，PCA2，3- 或PCA3，4-裂解酶完成。在I1宏基因组中含有不同的原儿茶酸4，5-和2，3-双加氧酶亚单位，除了来自糖胞杆菌的以外，这些都属于α变形菌。 5. 基因表达和蛋白质生物合成的时间曲线 在饥饿期之后我们添加新鲜的PF底物，对I1群落的宏转录组和蛋白质组进行了表征(图1c)。在每个取样点，宏转录组检测到所有基因的约70%，在宏蛋白质组约检测到6%。与t0相比，宏转录组中只有一小部分显著上调/下调，对应于第一时间点转录本的0.4/0.9%，第二时间点转录本的4.7/5%，第三时间点转录本的5.4/5.4%，在宏基因组中丰度高的箱(10、17、20和32箱)贡献的上调基因最多。一周后，在最后一个时间点t3，17和20箱的转录本持续上调，而10和32箱位点的转录本上调数量减少；I1群落中，每个时间点丰度低的成员贡献的下调转录本最多(图4a)。 图4 分箱对基因表达和蛋白合成的贡献 a. 在采样时间点(t1，t2，t3)，显著上调(“-u”，红色片段)和下调(“-d”，蓝色片段)转录本(T)和蛋白质(P)的量。b. 转录本(T)和蛋白质(P)的量在膜附着菌群中显著上调/在游离菌群中下调(“Fu”，红色片段)，或在膜附着菌群中下调/在游离菌群中上调(“Fd”，蓝色片段)。检测到的基因和蛋白质的数量由每个条带的大小来表示。颜色代表属于某个细菌类别的转录物和蛋白质。 从宏蛋白质组中共鉴定出8126个蛋白质组，在新的聚合物膜存在下培养7天后检测到的蛋白质含量最高(67%)。在每个时间点中都存在核心蛋白质组(≥3049，38%)，7天之后，含量最高的上调蛋白质组(921个蛋白质)持续存在。 整个实验中的α变形菌和γ变形菌的蛋白质生物合成最活跃，尤其是海洋杆菌属。在每个时间点，γ变形菌的蛋白上调的数量大于α变形菌(图4a)。 饥饿期后PF的加入引起了与中枢代谢相关的基因的上调，说明这种底物被用作了碳源，此外，生物膜形成相关途径(ko02025)在第一个和最后一个时间点转录水平上调，但在蛋白质水平不上调。细菌分泌系统(ko03070)在转录水平和蛋白水平上调，这可能是由于分泌蛋白如Ples和Mles的产量增加导致的。 ple628、ple629和ple453只在第二个时间点的宏转录组中表达显著增加，也是在宏蛋白质组中检测到的唯一Ples。Ple628和Ple453在整个时间序列中含量丰富并上调(图5)，蛋白质组中不存在其余的Ples，可能在PF的解聚中没有发挥重要作用，由于生物膜内的竞争，一些多余的和高成本的代谢功能可能会停止。 与Ples相似，在第二和第三个时间点，只有一个Mle(mle046)在宏转录组中被上调。Mle046是整个时间序列中I1宏蛋白质组中最丰富的蛋白质，也是唯一可以检测到的Mle蛋白(图5)。 重叠群1092 (ptpd)和12 箱(stpd)上的TPD簇在PF降解过程中发生转录。stpd基因在第三个时间点显著上调，而12箱的pht基因在第一个时间点上调；只有sTphA2和sTphA3蛋白存在，后者在最后一个时间点下调(图5)，且未检测到pht蛋白。在最后两个时间点ptpd基因表达没有显著变化，pTPD蛋白（如Mle046）在所有时间点的表达量高且没有显著变化。在蛋白质组中我们仅检测到6个PCD亚基，属于第10、17和20箱，以及两个未分箱的亚基，其最近的亲属来源于α变形菌。通常，PCD亚基在整个时间序列中亚单位的转录上调，而蛋白质生物合成下调，我们也未检测到12箱的PCD蛋白。 图5 PF降解基因和蛋白质的热图 不同时间点t1、t2、t3，膜附着(F)菌群在宏转录组(MT)和宏蛋白质组(MP)水平上可能参与PF生物降解的基因的变化。符号相反表示(F)中的变化量等同于游离菌群中的变化量。Ples(蓝色):ple453，ple628，ple611，ple629，ple201，ple200；Mles(红色):mle046，mle267，mle800，mle288；TPD簇基因(绿色):stphA2A3B和ptphA2A3BA1R，pht簇基因:pht3524。实心圆圈代表沿不同时间点的非差异基因表达和蛋白质生物合成。蓝色三角形表示蛋白质在薄膜附着部分(向上指的三角形)和游离菌群的部分(向下指的三角形)中是唯一的。转录物和蛋白质上调的为红色阴影。下调的为黄色阴影。 6. 膜附着与游离细菌的基因表达和蛋白质生物合成 膜附着和游离菌群的分类组成、基因表达和蛋白质生物合成有显著差异。在膜附着群落中约10%的转录本和5.4%的蛋白质上调，在游离菌群中12%的转录本和5%的蛋白质上调。游离菌群中特有的基因、转录本和蛋白质分别约为25%、28%、16%，膜附着菌群特有的基因、转录本和蛋白质分别约为11%、13%、16%。膜附着菌群的大部分转录本由32、28、21和5箱贡献，代表高丰度和低丰度成员(图4b)，然而，膜附着群落中的大多数蛋白质是由32箱产生的，其次是21箱。游离菌群10、17和21箱对的转录物贡献低于它们对蛋白质生物合成的贡献，低丰度的12和13箱对基因表达和蛋白质生物合成都有贡献。在生物膜宏转录组中，与生物膜形成、细菌分泌、群体感应和鞭毛装配相关的途径富集，但在宏蛋白质组中不富集；相反，宏蛋白质组显示脂肪酸代谢蛋白的富集，这可能与二羧酸的β-氧化代谢有关。 所有ple基因的表达都局限在膜附着菌群。与游离菌群相比，ple453和ple628基因在膜附着群体中表达上调，合成了更多的蛋白质(图5)，与时间曲线相似，我们未检测到Ple200和Ple201。我们在附着于膜的菌群中检测到Ple629，在时间曲线实验中未检测到。生物膜中32箱的丰度、代谢潜能和基因表达谱表明该物种可能参与PF解聚；在附着膜和游离菌群中mle046基因均高表达且表达水平无显著差异，但在游离菌群中检测到更多的Mle 046蛋白(4倍)；其他Mle基因表达水平较低，未检测到蛋白质；在膜附着和游离菌群中质存ptpd转录物和蛋白，其表达和生物合成水平在两种组分中相似，或者在游离菌群中上调。另一方面，stpd和pht转录本在游离菌群中上调，与时间曲线一致，我们只检测到sTph而没有检测到pht蛋白(图5)。而在蛋白质组中我们仅检测到两个PCA双加氧酶亚单位，在膜或游离菌群中没有显著上调或下调。10箱和12箱的PCA双加氧酶亚单位的转录物在膜附着菌群中上调，但我们在蛋白质组中未检测到。 讨论 本研究使用多组学方法阐明海洋微生物菌群对脂肪族-芳香族聚酯混合物的生物降解潜力，数据表明聚合物及其单体都可以被I1菌群矿化，I1菌群具有协同生物降解的功能，不同成员具有解聚、分解中间体和芳香单体的功能，如图6所示。 PF上的细菌群落与定值在其它塑料颗粒上的生物膜相似，主要由γ变形菌组成，γ变形菌中的海洋杆菌属在PF降解中起关键作用。两个海洋杆菌箱(21和32)的基因组都编码Ples。32箱可能进行PF的初始解聚(图6)，具有接近疏水基质的潜能，当培养物以二羧酸单作为唯一碳源时，缺乏Te降解基因的Bin 32含量丰富，此外，在膜附着菌群宏蛋白质组中二羧酸代谢相关的蛋白质富集，因此，很可能在解聚后，这种微生物在二羧酸单体上生长。一些依赖于细菌培养的方法不能准确地呈现环境中的降解过程，但我们的结果表明海洋脂肪族-芳香族聚酯降解基因与陆地微生物中相关基因非常相似。 游离菌群中α变形菌的丰度最高，主要由红细菌科的成员组成，一些红细菌科在海洋环境中具有游离和附着两种生活方式，在10和20箱的细菌中，这种生活方式尤为明显。I1群落中的α变形菌很可能以解聚后的可溶性寡聚体和单体为碳源，高表达的mle和tpd基因、大多数pcd基因存在于α变形菌。因此，我们可以认为α变形菌在芳香寡聚物和单体的矿化中起关键作用。 以Te和B作为唯一碳源时，12和7箱的生长速度超过了其他细菌，而当菌群在PF上生长时，它们的丰度较低(< 2%)。类似于IsPETase18对MHET的分解，在PF被Ples裂解后，B和Te最初可能以单酯BTe的形式存在，而不是以游离单体的形式存在。PF降解过程中细胞内BTe的存在进一步表明该单酯被吸收并用作碳源，而不是首先在细胞外裂解成单体，当培养物在PF上生长时，7和12箱被编码mle046的菌株所取代。由于mle046和ptpd基因都位于质粒上，很难准确说明哪些菌群使用BTe作为生长底物。在以PF为碳源时，菌群中10和17箱含量丰富，但以单体为碳源时几乎检测不到，基于这一结果，我们假设一种或两种细菌携带mle046和ptpd质粒，这些细菌可能吸收并以BTe作为碳源，当存在单体Te和B时，它们被12和7箱超越；当以PF为碳源时，菌群中的12和7箱可能以二级降解者的形式存在。 丰度较低的分类群在整个降解过程中活性也在增加，如9箱能代谢下游降解产物和泄漏的代谢物，在最后一个采样点贡献了大部分上调的蛋白质，该家族成员消耗了海洋生态系统中低分子量化合物(如乙酸盐、乙醇)。 基于解聚酶和下游降解基因的表达和蛋白质生物合成模式，我们得出结论：PF解聚是由膜附着群落完成的，膜附着菌群和自由菌群共同降解芳香低聚物和单体，从而完成PF的矿化。 图6 多组学数据的整合 PF膜在不同时间点(t1–t3)和生物膜内(F)协同生物降解的机制。由海洋杆菌合成的周质α/β水解酶(Ple628，Ple453)水解PF，产生1，4-丁二醇(B)与对苯二甲酸(Te)或癸二酸(Se)/己二酸(Ad)的低聚物和单酯。α变形菌Mle (Mle046)水解BTe的混合物产生Te和B。Te被转运到细胞中，被未知细菌的对苯二甲酸降解簇(pTPD)分解代谢，并被糖杆菌(sTPD)分解代谢。下游降解基因导致原儿茶酸(PCA)的形成。红色箭头表示基因翻译成功能性蛋白质；蓝色箭头表示蛋白质对底物的催化作用；绿色箭头表示通过底物的催化作用形成中间体；橙色箭头代表中间体从周围环境到细菌的运输；粉红色的箭头代表下游降解途径。色标代表上调(+)和下调(-)转录物(T)和蛋白质(P)。 |
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