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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 高通量代谢物分析为揭示代谢机制和识别生物标志物提供了更好的方法，银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性疾病；然而，代谢在银屑病发病中的作用尚不清楚。通过非靶向代谢组学方法，我们检测到银屑病患者中氨基酸和肉碱的显著改变；氨基酸靶向代谢谱分析发现，银屑病中有37种氨基酸发生改变，其中23种氨基酸显著上调，包括必需氨基酸(EAAs)和支链氨基酸(BCAAs)，而谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺则显著下调。肉碱靶向代谢组学分析鉴定出40种显著改变的肉碱，其中14种包括棕榈酰肉碱(C16)在银屑病中显著下调，而己酰肉碱(C6)和3-OH-十八烯酰肉碱(C18:1-OH)显著上调，而谷氨酰胺、天冬酰胺和C16水平与PASI评分呈负相关。此外，较高的左旋肉碱 (L-carnitine，LC(C0))丰度与IMQ诱导的表皮增厚和皮损中Th17细胞浸润显著减少相关，暗示补充LC(C0)可能是治疗银屑病的一种潜在疗法。我们的结果表明，氨基酸和肉碱的代谢在银屑病中发生了显著的改变，特别是EAAs、BCAAs和LC(C0)的代谢可能在银屑病的发病机制中起关键作用。 论文ID 实验设计 1. 采用非靶向代谢组学技术分析银屑病患者血浆代谢产物谱； 2. 采用氨基酸靶向代谢组学分析银屑病患者和IMQ诱导的银屑病样小鼠模型的氨基酸谱； 3. 采用肉碱靶向代谢组学分析银屑病患者和IMQ诱导的银屑病样皮炎小鼠模型中的肉碱变化情况； 4. 通过PASI评分来评估人血浆代谢物与银屑病严重程度的相关性。 实验结果 1. 非靶向代谢组学鉴定的银屑病血浆代谢产物谱 在非靶向代谢组学分析中，我们分别在正和负离子模式中检测到5529和4289个特征。主成分分析(PCA)显示两组间无显著性差异，但合并后的QC样本在正离子和负离子模式下聚在一起(图S2A)，表明LC-MS的真实性是合格的。我们采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)检测银屑病样本与健康对照组之间的差异，PLS-DA模型结果清晰地区分了银屑病与健康对照组的阳性和阴性模式，如图1A-B所示，而通过统计分析(VIP ≥ 1和 p < 0.05)确定的差异表达代谢物，如表S2所示。 为了探究差异特征的身份和功能丰富，我们搜索了数据库和代谢网络。如图1C-D和S1B-C所示，鉴别出的差异特征为α-氨基酸及其衍生物、肉碱及其酰基肉碱、谷氨酸及其衍生物以及其他化合物。通过代谢分析工具对通路进行分析，我们发现银屑病患者差异表达的代谢物富集于氨基酰-tRNA的生物合成和各种氨基酸的代谢通路，如丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸(图S3)。这些结果与之前的研究一致。此外，代谢网络预测验证了功能富集分析的结果，表明银屑病组的代谢以组氨酸和色氨酸代谢为中心(表S2)。 2. 银屑病患者的氨基酸谱和IMQ诱导的银屑病样小鼠模型的氨基酸靶向代谢组学鉴定 我们的非靶向分析显示银屑病患者血浆中氨基酸的显著改变，暗示氨基酸代谢可能在银屑病发病机制中发挥重要作用，因此，我们进行了氨基酸靶向代谢组学，鉴定出37个差异表达的氨基酸(图S4A)，其中，26例银屑病患者的变化大于对照组的1.5倍，包括23个氨基酸上调和3个氨基酸下调(图2A-B)。 IMQ是TLR-7/8的配体，可诱导小鼠银屑病样皮炎，模拟人银屑病的发病机制和全身炎症，包括IL-23/IL-17A-Th17轴促炎细胞因子和趋化因子水平升高。我们通过氨基酸靶向代谢组学分析IMQ诱导的银屑病样皮炎小鼠模型中的氨基酸谱。如图2C-D所示，我们发现IMQ治疗后有15种氨基酸的含量升高，这与人类银屑病患者的观察结果基本一致。在这15个氨基酸中，L-甲基组氨酸，高瓜氨酸，脯氨酸，肌氨酸，异亮氨酸和磷酸乙醇胺在连续处理3天和6天后继续增加，α-氨基丁酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸在连续处理3天后增加，第6天下降。然而，第6天的浓度仍然高于对照组的相应水平(图2D)。此外，IMQ连续治疗3天或6天的银屑病样皮炎小鼠血浆中37个具有显著差异的氨基酸被量化(图S4B)。 在银屑病患者和IMQ诱导的诱导小鼠银屑病样皮炎小鼠模型中具有显着差异的氨基酸包括谷氨酸，天冬氨酸，EAAs(图3A-B)，BCAAs (异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸)(图3A-B)，磷酸丝氨酸，鸟氨酸，其他疏水性氨基酸(包括丙氨酸和脯氨酸)以及芳香族氨基酸(AAA，苯丙氨酸和酪氨酸)。有趣的是，这些氨基酸参与了包括肥胖和胰岛素抵抗在内的代谢性疾病，而这些疾病与银屑病相关。 图2 在人类和小鼠血浆中检测了氨基酸靶向代谢组学 (A) 37种氨基酸在银屑病组与健康组的倍数变化分布。(B)人血浆中不同氨基酸定量热图。(C) IMQ诱导小鼠模型初始、3、6天各时间点的氨基酸差异热图。(D) IMQ诱导小鼠模型中差异氨基酸在三个时间点上的浓度分布。 图3 人类和小鼠的血浆中有7种氨基酸发生了显著变化 人(A)和小鼠(B)血浆中赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和BCAAs(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)7种不同氨基酸的箱线图。 3. 肉碱靶向代谢组学在银屑病患者和IMQ诱导的银屑病样皮炎小鼠模型中的应用 非靶向分析显示，银屑病患者的游离肉碱(C0)和丁酰肉碱(C4)水平显著降低，脂肪酸β-氧化通路在银屑病发病机制中起重要作用。由于肉碱是一种参与脂肪酸β-氧化的必需能量物质，我们通过肉碱靶向代谢组学研究了酰基肉碱在银屑病中的作用，并确定了40种具有显著差异的酰基肉碱(图S5A)。在这些酰基肉碱中，银屑病患者中有16种酰基肉碱的变化大于健康对照组的1.5倍，包括14种酰基肉碱的下调和2种酰基肉碱的上调(图4A-B)。 在IMQ诱导的银屑病样小鼠模型中，我们鉴定出34个酰基肉碱(图S5B)，其中11个酰基肉碱经IMQ处理后差异表达(t-test, p<0.05)，包括C10、C12和C14种。实验发现连续3天IMQ治疗的银屑病小鼠比对照组有更高的酰基肉碱水平，而治疗6天的银屑病小鼠比正常对照组有更低的酰基肉碱水平(图4C-D)。这些发现表明，IMQ诱导的银屑病小鼠体内存在与银屑病患者体内类似的肉碱类似物代谢紊乱。 图4 酰肉碱在人类和小鼠的血浆中都被量化 (A)银屑病组与健康组酰基肉碱的倍数变化分布。(B)人血浆中不同酰基肉碱定量热图。(C)IMQ诱导小鼠模型在起始、3、6天各时间点的差异酰基肉碱热图。(D) IMQ诱导小鼠模型中不同酰基肉碱在三个时间点上的浓度分布。 4. 鉴定的血浆代谢物与银屑病严重程度的相关性 通过PASI评分来评估银屑病的严重程度，因此，我们通过将银屑病队列分为轻度(PASI≤10, n = 25)和中度-重度组来探讨确定的代谢物与银屑病严重程度之间的关系(PASI > 10, n =20)，PASI评分与氨基酸或酰基肉碱水平的Pearson相关性分析见图5A-B和表S3。我们发现谷氨酰胺、天冬酰胺和C16水平与PASI评分呈负相关，而丙氨酸、肌肽、鸟氨酸和磷酸丝氨酸(Pser)水平呈正相关(图5A-B)。这些数据强调了谷氨酰胺、天冬酰胺和C16对寻常型银屑病潜在的有益作用，为疾病严重程度评估、诊断和确定银屑病潜在的治疗靶点提供了新的见解。 接下来，我们使用多变量受试者工作特征(ROC)曲线分析来区分几种氨基酸、肉碱和酰基肉碱。如图5C和S6所示，天冬酰胺、肌肽和磷酸丝氨酸的组合与PASI相关，能够识别AUC在0.98以上的银屑病。 图5 氨基酸和酰基肉碱与银屑病严重程度的生物标志物分析 (A和B) PASI评分与氨基酸或酰基肉碱的Pearson相关系数分布。(C)采用单因素分析和组合分析，根据所选氨基酸绘制受试者工作特征(ROC)曲线。 5. 补充左旋肉碱可显著减轻IMQ诱导的银屑病样皮炎 我们的结果显示，相对于对照组，银屑病患者血浆中LC(C0)和大多数酰基肉碱种类的浓度显著降低(图4A-B)。与对照组小鼠相比，连续6天外用IMQ诱导的银屑病小鼠体内这些代谢物也有所减少(图4C-D)。这些观察结果与LC(C0)可能对银屑病有潜在的治疗作用的可能性相一致。为了验证补充LC(C0)可以调节银屑病的假说，我们对小鼠进行了干预研究。我们用LC(C0)治疗IMQ诱导的银屑病小鼠，研究其代谢，用药方案和每日体重记录如图6A所示。正如预期的那样，与对照组相比，连续6天外用IMQ后第19天，补充LC(C0)显著降低了IMQ诱导的表皮增厚(图6B)。流式细胞术分析显示，补充LC(C0)显著降低了IMQ介导的皮损中Th17细胞的浸润，但对Th1细胞无影响(图6C)；补充LC(C0)后，皮损中Treg细胞的浸润也增加(图6D)；此外，补充LC(C0)显著减少了IMQ诱导的皮损和脾脏浸润性Gr-1+炎症细胞的积累，特别是单核型Gr-1+炎症细胞的积累，但不影响粒细胞类型(图6E)。我们的结果证实了LC(C0)的抗炎作用，它可以减轻IMQ引起的银屑病炎症。 讨论 近期研究表明，由于涉及IL-23/Th17轴的低级别慢性炎症状态，包括腹部肥胖和血清血脂异常等代谢紊乱与银屑病风险呈正相关，银屑病已被确定为代谢性疾病的危险因素，也有越来越多的证据为这一流行病学观察提供了支持，例如，在糖尿病中发现IL-23和IL-17水平升高，表明它们在β细胞损伤中具有协同作用；此外，在肥胖中，IL-23的浓度升高和脂肪组织中Th17亚群的扩张已经被观察到。因此，银屑病与代谢性疾病的发病可能存在共同的代谢途径。我们的研究集中在人类和小鼠银屑病中氨基酸和肉碱代谢的显著改变。 氨基酸代谢紊乱普遍存在于代谢紊乱和银屑病中。BCAAs是一组由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的EAAs。EAAs在银屑病中的研究很少，它只能通过饮食获得，不能通过其他代谢产物在体内合成。在肥胖相关的人类中，BCAA水平升高已被广泛观察到，与代谢性疾病中的观察结果一致，我们的结果揭示了银屑病患者和IMQ治疗的银屑病小鼠血浆中循环BCAAs升高(图3 )。我们还发现EEA在人和小鼠体内均显著升高(图3 )。因此，代谢紊乱可能是银屑病发生发展的危险因素。 目前循环BCAAs是否可以作为代谢紊乱的生物标志物和/或作为疾病的致病因素尚不清楚。越来越多的证据表明BCAAs具有促炎作用，例如，BCAAs通过NF-κB介导的炎症促进内皮功能障碍。BCAAs，尤其是亮氨酸，是mTOR的激活剂，可通过mTORC1活化促进氧化应激和炎症反应。本研究观察到银屑病BCAAs水平显著升高，暗示这些氨基酸可能在银屑病的发病机制中发挥重要作用，这一可能性有待进一步研究，而有证据表明，使用抑制剂恢复BCAA分解代谢通量或减少蛋白质（BCAA）的摄入量，是治疗肥胖相关胰岛素抵抗的有效策略。 BCAAs中含量最高的食物是肉类、鱼类、鸡蛋和乳制品，因此，限制这些高蛋白饮食可能对银屑病患者有益。据报道，银屑病患者常表现出红肉和脂肪摄入较高而膳食纤维摄入较低等不平衡饮食习惯，因此加重银屑病的途径可通过核苷酸结合域的激活、富含亮氨酸重复序列的家族、TNF-α / IL-23 / IL-17通路和活性氧等。由此，营养策略可能有利于缓解银屑病症状和严重程度。 谷氨酰胺是一种免疫调节营养物质，是血浆中最丰富的游离氨基酸，在提供三羧酸循环(TCA循环)的中间产物方面具有重要的代谢作用。高度增殖的细胞，如癌细胞，特别依赖谷氨酰胺进行生物合成。此外，在创伤、感染、败血症等分解代谢状态下，我们观察到了全身谷氨酰胺缺乏的情况。与前期研究一致，我们发现银屑病患者血浆谷氨酰胺水平显著下降，谷氨酸水平显著升高(图2 )。这些发现支持了谷氨酰胺环化途径显著参与寻常型银屑病发生发展的假说。此外，在谷氨酰胺和谷氨酸喂养的小鼠中，谷氨酰胺水平与BCAAs之间存在显著的负相关关系，这在其他研究者的心脏研究中也得到了证实。这些观察结果强调了谷氨酰胺对心脏代谢风险的潜在益处，并表明谷氨酸可能会带来不利的代谢风险。据报道，在重症监护环境下，肠外谷氨酰胺补充可以降低发病率和死亡率。更重要的是，在银屑病中，我们发现谷氨酰胺水平与PASI评分呈负相关(图5A)，这有力地支持了我们的假设，即补充谷氨酰胺或抑制谷氨酸积累对银屑病患者有利，至少对伴有代谢性疾病的患者有利。 除了对银屑病患者进行代谢分析外，我们首次研究了IMQ诱导的银屑病炎症中氨基酸和肉碱的代谢变化。通过对银屑病患者和IMQ诱导的银屑病炎症小鼠的代谢组学比较，暗示氨基酸和肉碱参与了银屑病的发病过程，并/或作为银屑病的生物标志物，这一可能性有待进一步研究，而我们发现补充LC (C0)能明显减弱IMQ诱导的小鼠银屑病样炎症(图6)，揭示其在银屑病中的抗炎作用。 在本研究中观察到的银屑病患者循环中肉碱和酰基肉碱的不足(图4A-B)，也可以解释为皮损中脂肪酸氧化的增加和肉碱棕榈酰基转移酶-1( CPT-1 )活性的增加，归根到底是由于增殖细胞的能量消耗迅速增加。CPT-1是负责线粒体中长链脂肪酸氧化速率的关键酶，有报道称用依托莫昔抑制CPT-1活性可缓解银屑病炎症。与这些观察相一致，我们发现银屑病患者的C16物种水平，包括C16、C16-OH、C16:1、C16:1-OH、C16:2、C16:2-OH均有所降低(图4A-B)；更重要的是，我们发现C16与PASI评分呈负相关(图5B)，认为C16是评估银屑病严重程度的潜在保护标志物；此外，位于线粒体内膜上的肉碱-酰基肉碱转移酶(CACT)和肉碱棕榈酰转移酶-2 (CPT-2)也可能分别成为预防酰基肉碱易位和转化的治疗靶点。 结论 我们的研究证明了将寻常型银屑病患者和IMQ诱导的银屑病小鼠的临床，实验和代谢组学数据整合并进行详细表型分析的潜在价值。我们的研究结果表明，氨基酸，尤其是EAAs和BCAAs，以及肉碱代谢在银屑病中发生显著改变，可能在银屑病的发病机制中起关键作用，但还需要进一步的研究来阐明EAAs、BCAAs和谷氨酸水平升高、谷氨酰胺水平降低、肉碱和酰肉碱水平显著降低是否可以预测银屑病并探讨其潜在机制。 |
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