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编译：Jonie、song，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 世界人口增长的同时，对食物的需求也越来越多，尤其是蛋白质。反刍动物作为高蛋白的供应源，起着关键作用，其瘤胃发育关系到将植物材料转化为人类食用食物的早期发酵。先前的研究已经证明了瘤胃特异性细菌、细菌的密度以及相关的非编码RNA的存在。为探究宿主-微生物相互作用在调节反刍动物瘤胃发育中的作用，研究人员采集了初生牛犊在30分钟、第1周、第三周、第6周的瘤胃样品（组织和内容物），提取DNA用于全基因组测序，随后进行宏基因组分析以探讨瘤胃微生物在整个小牛生长过程中的变化。随后，利用实时荧光定量检测了肠道细菌的密度。将用于提取的RNA和DNA的瘤胃组织样品保存在福尔马林中，利用Axiovision软件测量瘤胃乳头的长度和宽度，并利用相应的气相色谱测量几种脂肪酸的含量。随后，转录组分析瘤胃微生物组与小牛表型性状变化的关系。结果表明在没有固体饮食的情况下，从生命的第一周也观察到活性复合碳水化合物发酵罐和具有甲基辅酶M还原酶活性的古菌的定殖。整合微生物宏基因组学和宿主转录组学显示只有26.3％的mRNA转录，46.4％的miRNA对VFA有反应，而其他的则是致癌基因。本研究揭示了一种高活性的早期微生物组，它可以在细胞水平上调节新生小牛的瘤胃发育，并且miRNA可以协调这些宿主-微生物的相互作用。 论文ID 原名：Regulation of rumen development in neonatal ruminants through microbial metagenomes and host transcriptomes 译名：通过微生物宏基因组和宿主转录组调节新生反刍动物瘤胃发育 期刊：Genome Biology IF：14.028 发表时间：2019年 通讯作者：Le Luo Guan 通讯作者单位：加拿大阿尔伯塔大学农业、食品和营养科学系 DOI号：https:///10.1186/s13059-019-1786-0 实验设计 本研究以初生犊牛为研究对象，选取产出后犊牛18只进行分时间段安乐死处理，分为30min、第1周、第3周和第6周，并取瘤胃样品（组织和内容物）于-80℃低温保存。提取瘤胃内容物样品中的总DNA，对样品的总DNA进行宏基因组文库构建，并进行定量分析瘤胃微生物在整个小牛生长过程中的变化。利用实时荧光定量PCR评估并计算古细菌的密度。将处理过的瘤胃组织样品提取RNA和DNA，进行瘤胃乳头和挥发性脂肪酸的测量，并计算浓度。最后利用转录组分析瘤胃微生物组与小牛表型性状的关系，基于GO以及KEGG通路进行micRNA分析以确定瘤胃微生物与小牛表型性状的关系。 结果 1 微生物群活性和功能性在出生时就已形成 2 瘤胃微生物组在早期生活中快速变化 宏基因组学分析表明，断奶前小牛的瘤胃（1周，3周和6周）被细菌、古细菌、原生动物、真菌和病毒定植（原文图S1），细菌仍占主导地位。在生命的第一周内，小牛瘤胃中的细菌密度增加了438倍（基于RNA；P<0.05）和7829倍（基于DNA；P=0.02）（图1a）。鉴定的细菌属于14种不同的门，由厚壁菌门、拟杆菌属、变形菌门和放线菌控制（图1b）。共鉴定出167个属，具有9.3±2.2％未分配的序列，其中63个是主要的细菌属（在至少1个样品中丰度>1％）。在检测到的属中，普氏菌属，双歧杆菌属，棒状杆菌属，链球菌属，乳酸菌属，梭菌属，葡萄球菌属，芽孢杆菌属，弯曲杆菌属，假单胞菌属，耶尔森氏鼠疫杆菌，奈瑟氏菌属，弯曲杆菌属，嗜血杆菌属，博客氏菌属，弧菌属和布鲁氏菌属存在于所有断奶前的小牛中。所鉴定的细菌属的流行程度随小牛年龄而变化，当比较第1周与第3周和第6周时观察到显着差异（原文附加文件1）。例如，微生物宏基因组中普氏菌属的丰度在第1周比第3周和第6周更高（P <0.05）（附加文件1）;然而，基于qPCR的活性普沃氏菌密度随着小牛龄而在数值上增加（P>0.1）（表1）。从瘤胃微生物宏基因组的第一周观察到更高的瘤胃球菌属（P<0.05）。基于RNA的定量还揭示了第一周内瘤胃中的黄乳球菌和白氏乳杆菌的定殖（表1）。 总共在SEED子系统层次结构中观察到28个1级和168个2级功能，这些功能在断奶前的小牛中（从第1周到第6周）。其中，与“蛋白质和碳水化合物代谢”相关的子系统主导了瘤胃微生物组（图1c）。“蛋白质代谢”主要由与“蛋白质生物合成”相关的微生物功能组成，而“碳水化合物代谢”包括与SEED子系统层级2级的“中心碳水化合物代谢”相关的微生物功能。当比较第1周小牛与第3周和第6周小牛时，主要鉴定差异丰富的微生物基因。总共从所有断奶后的小牛中鉴定出3443个微生物基因，但具有较高的个体差异。在第1周和第6周（396）之间观察到大多数差异丰富的微生物基因，接着是第1周和第3周（134）以及第3周和第6周（59）。在断奶前的瘤胃微生物组中鉴定了19种编码糖苷水解酶（GH）的微生物基因，其相对丰度小于小牛年龄。α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶SusB、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶II前体、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶2、β-半乳糖苷酶大亚基、葡聚糖1,6-α-葡萄糖苷酶和丰度麦芽糖-6'-磷酸葡糖苷酶在第6周比第1周和第3周更高。 图1 从出生到出生后前6周的瘤胃微生物组的建立和瘤胃乳头的发育 3 从生命第一周开始在新生小牛中建立活性古菌 使用基于RNA的实时PCR对16S rRNA基因进行定量分析显示活性古菌在生命的第一周定植（图1d），而第1周（图1d）古菌密度与第3周和第6周相比低10000倍。类似地，基于宏基因组学的测序揭示了从生命的第一周开始的古细菌定植（0.03±0.01％），其在第3周和第6周分别增加了相对丰度41和54倍。无论第一周是否存在古细菌，甲基辅酶M还原酶基因（mcrA）仅在第3周（0.2±0.0003％）和第6周（0.2±0.0001％）的小牛的微生物宏基因组中检测到。与第3周和第6周相比，第1周编码更高丰度的微生物基因编码古菌特异性糖酵解酶（葡萄糖-6-磷酸 - 异构酶，果糖-二磷酸醛缩酶，2,3-二磷酸不依赖磷酸甘油酸变位酶和非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。宏基因组学测序进一步揭示，经前期瘤胃古菌主要由甲烷微菌纲，甲烷杆菌科和甲烷球菌科组成（图1e）。在微生物宏基因组谱中观察到的甲烷杆菌在第3周（39.0±9.8％）和6（36.1±14.3％）比第1周（9.6±6.0％）更高。虽然在所有小牛中不存在单一属，但在第6周小牛的60％中观察到甲烷短杆菌，热杆菌、甲烷杆菌和甲烷盘菌属。 4 瘤胃上皮细胞发育和断奶前小牛的VFA特征 与断奶前小牛相比，出生时瘤胃上皮显示出独特的结构（图1f）。出生后不久，小牛瘤胃内没有分离出突出的乳突或复层鳞状上皮；然而，乳突发育是明显的（图1f）。新生牛犊的瘤胃上皮由大量有核鳞状细胞组成，厚度为279.9±7.6μm，后来在6周内发育成678.1±41.1μm长的乳头。在三个年龄组中，瘤胃乳头的长度和宽度的增加显着不同（表1）。总VFA、乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐、戊酸盐、异丁酸盐和异戊酸盐的浓度随着年龄和饮食变化的增加而增加（表1）。然而，只有乙酸盐和戊酸盐的摩尔比例显示出与年龄相关的变化，而丁酸盐的摩尔比例在生命的前6周内占总VFA的13-16％（表1）。此外，VFA的浓度与活性黄氏乳杆菌密度和瘤胃乳头发育正相关。 5 微生物-宿主转录组相互作用可能影响瘤胃上皮细胞的发育和组织代谢 图2 转录组网络、小牛表型性状和细菌组成之间的关联。 6 microRNAome协调微生物组-宿主转录组串扰 为了鉴定宿主微生物相互作用的潜在调节机制，使用WGCNA分析使用相同动物在先前研究中产生的microRNAome数据（364±17个miRNA）以鉴定它们与小牛表型性状的关系。基于miRNA的共表达，将瘤胃microRNAome聚类成9个模块（R1-R9）（图4a）。除异戊酸外，R7 miRNA模块与小牛表型性状和VFA浓度呈负相关（图4a）。使用targetScan和mirBase显示在R7中共表达的miRNA总共具有3710个预测基因。在R7预测的基因中，3847（约96％）在本研究的瘤胃组织转录组中表达。此外，预测的3710中的258个在从瘤胃组织转录组鉴定的M10模块中共表达。时间上下调的R7成员miR-375（图4b）参与“瘤胃上皮形态发生 ”和“血管发育相关”功能（图4c）。R8 miRNA模块（40种miRNA）也与小牛年龄、乳头宽度、乙酸盐和戊酸盐呈负相关（图4a）。在R8模块中共表达的miRNA总共具有2751个预测的靶基因，并且在本研究的小牛瘤胃组织转录组中表达了这些基因中的2649（约96％）。功能分析显示，在R8模块中共表达的miRNA参与“蛋白质定位和运输”和“细胞运动”。然而，只有R7 miRNA的靶标在M10模块中共表达。 图4 瘤胃miRNA谱（miRNA表达）和瘤胃微生物群（细菌属，VFA浓度）之间的关联。 通过探索表达R7 miRNA、M10基因和细菌属的相对丰度之间的关系，进一步评估miRNA在调节宿主-微生物互作中的作用。与细菌簇1和6相关的近37％（55/147）的M10基因（图2d）被在R7中共表达的28种miRNA靶向。其中，bta-miR-2904，bta-miR-199b，bta-miR-541，bta-miR-574和bta-miR-423-5p与包含普氏菌，拟杆菌，瘤胃球菌属，丙酸菌属的细菌簇相关，克雷伯氏菌（图2d中的簇1）和巨型球菌（图4d）。此外，这5种miRNA靶向与宿主转录组中鉴定的与ZNF相关的65种不同基因。 图5 在发育中的瘤胃中提出的宿主-微生物相互作用及其调节机制。早期瘤胃微生物群通过与转录组的直接和间接（miRNA）相互作用改变瘤胃发育。 讨论 哺乳动物在出生期间和出生后，在子宫内无菌的腔道内迅速繁殖的微生物群不断地与宿主相互作用，以维持新陈代谢和健康。早期肠道微生物组被认为对人类健康具有长期影响。该研究揭示了在出生前反刍动物瘤胃中建立了动态、密集和活跃的微生物组，其在生命的前6周经历了使用微生物宏基因组测序和基于RNA的微生物定量的快速变化。 本研究中使用的基于RNA的定量分析揭示了出生后几分钟内活性细菌的定植，表明该过程可能在分娩过程中开始，从一小时延长至3小时。本研究揭示了活性黄乳球菌，白乳球菌，埃利希氏体和普沃氏菌的殖民化，这是一种降解植物多糖（纤维素，半纤维素，木聚糖和聚糖）的经典瘤胃细菌，从第一周开始生活，当小牛只喂牛奶。这些物种的密度增加与VFA浓度升高以及第3周和第6周小牛的乳头长度和宽度增加相吻合。这一发现表明，固体饮食的引入通过影响瘤胃微生物组成和功能来刺激瘤胃乳头的快速生长。传统上，固体饲料被认为是瘤胃发育的主要驱动因素，它刺激微生物发酵。然而，纤维素分解菌的出现和木聚糖酶和淀粉酶的活性可以从出生的第二天开始检测。因此，研究结果表明早在第一周就存在活性微生物组，需要详细了解它们在瘤胃发育中的作用。 从瘤胃中去除H2对微生物发酵具有抑制作用，提高了发酵速率，可以认为是瘤胃发育的特征之一。在3W和6W小牛的瘤胃微生物宏基因组中存在mcrA基因，但在1W小牛中没有，这表明在引入固体饮食后小牛瘤胃中产甲烷过程的激活。最近的一项研究报告说，仅饲喂代乳粉和奶油的羔羊比饲喂干草的羔羊产生的甲烷少84％。此外，在向这些代乳粉和奶油喂养的羊羔引入干草的4天内，甲烷的产量增加了15.9倍。因此，这些观察结果表明，将固体饲料引入预发酵剂中，可以激活产甲烷作用，随着微生物发酵的增加，有效降低瘤胃H2压力。通过操纵断奶前的饮食，古细菌的组成和羔羊体内甲烷的产生已经被长期控制。本研究中观察到的高异质性和低丰富性代表了断奶前古菌群落的建立和不稳定，很容易通过饮食改变。因此，通过断奶前犊牛早期瘤胃产甲烷菌的改变，可以促进瘤胃微生物发酵，减少瘤胃产甲烷。 在本研究中使用微生物宏基因组学以及基于DNA和RNA的定量分析表明，出生时小牛瘤胃中不存在产甲烷古菌和原生动物。虽然过去以饲喂为基础的研究报道古生物在出生后2-4天开始定植，但古兹曼及其同事使用基于qPCR的方法检测了出生后0-20分钟内采集的瘤胃样本中的古细菌。与古细菌相似，在本研究中使用的新生小牛（0天）的瘤胃中未检测到原生动物。 基于RNA测序的宿主转录组分析已在牛中广泛研究，以了解在系统生物学的分子水平上断奶、年龄、饮食和代谢紊乱的瘤胃组织中发生的变化。本研究探讨了出生后宿主转录组的变化以及瘤胃发育过程中宿主-微生物相互作用背后的分子机制。对宿主转录组和微生物宏基因组的整合分析揭示了早期瘤胃发育的潜在分子机制，其可分为微生物驱动和致癌机制（图5）。只有3个宿主基因模块（3595个基因，26.3％的转录组）和2个宿主miRNA模块（169个miRNA，46.4％的microRNAome）与VFA的浓度和乳头的发育呈正相关或负相关，表明只有一部分宿主转录组是微生物驱动的，而其中大多数是个体发育的（图5）。 Sommer及其同事也报道了10％的成年小鼠肠道转录组受到肠道微生物群的调控。然而，研究结果表明，新生牛瘤胃组织转录组的微生物驱动调控更为密集。致癌基因miRNA和基因模块显示3个miRNA-mRNA对miR-25和脂肪酸结合蛋白7（FABP7）、miR-30和整合素连接激酶（ILK）、miR29a和血小板衍生生长因子α多肽（PDGFa）参与瘤胃发育（图5）。FABP7参与“脂肪酸摄取，转运和代谢”和ILK介导的“细胞骨架组织”中的信号转导，而PDGFa参与肠绒毛形态发生。先前已经提出了对小牛瘤胃发育的个体发育控制。 M10基因模块中鉴定的宿主基因和R7 miRNA模块的预测靶基因为鉴定宿主-微生物相互作用及其在发育瘤胃中的潜在调节机制提供了共同点（图5）。在M10基因模块共表达的宿主基因中，约有22%(235/1070)与之前一项研究中发现的差异表达基因相似，该研究检测了犊牛从代乳品(42天)到干草/谷物(56-72天)的瘤胃上皮基因表达变化。当犊牛从基于代乳粉的饮食（42天）到以干草/谷物为基础的饮食（56-72天）断奶时，这些235个常见基因在瘤胃上皮转录组中差异表达，但在第14天至第42天接受牛奶替代品时，则与小牛年龄无关。在本研究中，在引入固体饮食后第1周与第3周和第6周比较时，这235个基因中的87个差异表达。这些宿主基因与VFA浓度之间的强烈正相关表明它们可能对瘤胃发酵中饮食驱动的变化有反应，并可能促进早期瘤胃发育。Connor及其同事也发现过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARA）是断奶过程中瘤胃上皮发育的重要分子机制。虽然PPARA在本研究中使用的所有断奶前小牛中都有表达，但它没有显示出小牛年龄的时间表达模式。然而，在M10宿主基因模块中共表达并且与“微生物碳水化合物代谢”相关的2级微生物功能的相对丰度相关的PPARG的表达随着小牛年龄而上调。与成年牛相似，小牛瘤胃组织中PPARG的表达高于PPARA的表达。PPARG在反刍动物中得到广泛研究，其在瘤胃中的表达水平仅次于其在牛脂肪组织中的表达，它在结肠中诱导上皮细胞增殖，上调鼻上皮细胞内的屏障功能，也是通过丁酸盐刺激肠道炎症的调节因子之一。丁酸盐通过抑制HDAC表现出表观遗传上调PPARG。HDAC3(在M18宿主基因模块中共同表达)的表达与瘤胃乳头的长、宽、丁酸盐浓度呈负相关，通过调节宿主转录组，进一步强化了丁酸盐对瘤胃早期发育的正向影响。最近的一项研究还报道，肠道微生物群衍生的丁酸盐通过影响小鼠肠上皮中HDAC的表达来影响组蛋白的巴豆酰化。这些发现共同暗示HDAC的抑制可能是微生物群及其代谢物（丁酸盐）调节宿主转录组的机制之一。因此，作者推测除了影响细胞凋亡外，丁酸还可能作为HDAC抑制剂和PPARG激活剂参与瘤胃发育。观察到宿主PPARG的表达与VFA的浓度以及与“微生物碳水化合物代谢”相关的微生物功能之间的正相关性表明其参与了瘤胃组织对微生物发酵反应的整体发育。 ZNF是调节多种功能的宿主转录因子，包括“DNA的识别”、“RNA的包装”、 “转录的激活”、“蛋白质折叠和装配”、以及“细胞凋亡的调节”。锌（ZNF的主要成分）的吸收也在山羊儿童早期瘤胃乳头发育和角化中起重要作用。本研究揭示，与瘤胃相关的5个R7 miRNA和8个M10基因与瘤胃微生物宏基因组中鉴定的相同细菌属（普氏菌属，拟杆菌属，丙酸杆菌属，瘤胃球菌属）的丰度相关，表明早期微生物群可能通过锌的吸收影响瘤胃发育，这种相互作用可能通过miRNA调节（图5）。 在本研究中，miRNAs的表达与早期微生物群之间存在着直接(细菌数量)和间接(VFA浓度)的关系。与蛋白质编码基因相比，miRNA的比例更高（169/364或46.4％的microRNAome）。宿主（3595 / 13,676或26.3％的转录组）与VFA的浓度相关，进一步证实了研究者之前对miRNA与微生物之间相互作用的发现和推测。来自R7的VFA相关miRNA，miR-375，抑制通过Wnt /β-连环蛋白途径进行肺泡上皮细胞分化，参与大鼠的“组织分化”和“器官发生”。miR-375的时间下调及其与VFAs浓度和乳突发育的负相关表明，miRNA调控机制可以由微生物代谢物启动。因此，从宿主转录组中鉴定的M10和R7模块确实是生物学的。在瘤胃发育过程中非常重要，可能成为探索宿主-微生物相互作用及其调节机制的潜在候选者（图5）。 在本研究中，瘤胃内容相关微生物组产生的数据主要用于探讨影响早期瘤胃发育的宿主-微生物相互作用。尽管表皮（瘤胃组织附着）微生物群占整个瘤胃微生物组的一小部分（1-2％），但其组成和功能也可能由于其与宿主的直接相互作用而促进组织发育。然而，由于使用的犊牛数量有限（n=3），观察到表皮细菌分类群和转录组的相对丰度之间没有强烈关联。为了完全了解瘤胃外膜微生物组对早期瘤胃发育的作用，进行环境转录组学以对宿主和外界微生物组进行测序的未来研究可能是非常重要的。 结论 研究证明瘤胃定植在分娩过程中开始，并且反刍前瘤胃微生物群具有高度活性，即使从生命的第一周开始也可以发酵固体饮食。由早期微生物组产生的VFA通过与宿主转录组和microRNAome相互作用与瘤胃组织代谢和上皮的发育相关。因此，研究表明早期喂养管理与断奶期具有同等的重要性，可能会促进瘤胃发育并促进断奶过渡。研究结果进一步说明miRNA可以协调新生小牛早期瘤胃发育过程中的宿主微生物相互作用，这种现象可能适用于所有哺乳动物物种的早期肠道发育。因此，有必要深入了解新生牛肠道中的宿主-微生物相互作用，以阐明早期微生物群对宿主的长期影响。
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