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编译：月中霜，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 草药配伍是指在中药配方中要结合哪些草药的知识。对中药配伍的认识不足是中药在西方社会应用和推广遇到的的关键性问题之一。由于草药的化学成分十分复杂，因此基于草药植物本身而不是植物组分相关次生代谢产物的相容性研究显得更加简单。研究人员采用转录组分析方法研究了复方苦参注射液（CKI）中两种植物提取物（苦参和白土苓）联合应用的效果和相互作用。根据已知的化学成分结合体外细胞毒理实验结果，作者发现复方苦参注射液中的主要成分和毒理效应主要来源于苦参提取物。研究人员对单一草药提取物和复方苦参注射液分别处理MDA-MB-231细胞后获得的转录组数据进行分析，结果显示苦参主要作用于复方苦参注射液中大部分的细胞毒性和癌相关通路的扰乱，如细胞周期和DNA复制。研究人员也发现白土苓不仅能够增强苦参在CKI中的细胞毒性作用，还能够激活免疫相关通路。研究人员分析预测发现复方苦参注射液中的白土苓能够引起IL-1β 基因的上调，而他们的ELISA结果也证实 IL-1β的蛋白表达发生上调。综上所述，这些发现有助于解释CKI中苦参和白土苓联合应用的基本原理，同时也表明利用单味草药提取物进行转录组分析是了解草药配伍性的有效方法。 论文ID 原名：Understanding the Mechanistic Contribution of Herbal Extracts in Compound Kushen Injection With Transcriptome Analysis 译名：通过转录组分析了解复方苦参注射液中植物提取物的作用机制 期刊：Frontiers in Oncology IF：4.137（2区） 发表时间：2019.07 通讯作者：David L. Adelson 通讯作者单位：阿德莱德大学生物科学学院振东澳中传统中医分子中心 DOI号：doi.org/10.3389/fonc.2019.00632 实验设计 作者通过高效液相色谱技术分析复方苦参注射液（CKI）以及单一提取物注射液中的主要组分，了解CKI中各种化学组分的来源。然后作者比较了CKI以及单一注射液的抗癌作用效果，测定细胞活力和细胞凋亡率。接下来，作者分别用CKI、苦参注射液和白土苓注射液处理MDA-MB-231细胞株系，分析其转录组变化情况。另外，作者通过q-PCR验证已知的对CKI的有重要影响的几个基因来验证转录组测序的准确性，通过ELISA检测验证了IL-1蛋白水平的变化。 实验设计 1. 利用高效液相色谱分析复方苦参注射液和单一提取物注射液的组分 为了获得有关复方苦参注射液（CKI）中的植物特异性组分的有关信息，研究人员使用高效液相色谱法（HPLC）比较CKI和两种单一草药提取物/注射液中的化合物（图1）。从色谱图可以看出，CKI中大部分主要化学成分来源于苦参注射液。相比之下，可以在白土灵注射液中检测出的化合物很少，仅是CKI中一种主要化合物的来源。与9种标准品化合物进行比较后发现，其中8种苦参中衍生出的化合物（腺嘌呤，N-甲基胱氨酸，槐定碱，苦参碱，槐果碱，氧槐果碱，氧化苦参碱和三叶草素）被证实存在于CKI中。白土苓中的对照标记化合物甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷仅在CKI和白土苓注射液中检测到。这些结果表明CKI中包含的主要化合物来源于苦参和白土苓，而苦参中包含CKI中的大多数化合物。 图1 CKI、苦参和白灵注射液的高效液相色谱图谱。 2. 复方苦参注射液和单一草药注射液的抗癌作用比较 先前的研究结果显示CKI能够抑制MCF-7细胞扩散并诱导其凋亡。为了确定单一注射液是否具有与CKI相似的表型效应，研究人员使用三种不同的细胞系MDA-MB-231， A431 和 HepG2，对其进行了XTT分析来测定细胞活力。结果显示在三种细胞系中，苦参比白土苓具有更强的细胞毒性作用。然而，流式细胞仪测定的细胞凋亡率显示，单一注射液均未产生与CKI相当的凋亡效应（图2A）。与XTT测定的细胞活力结果一致，CKI具有更高的细胞凋亡率，而白土苓处理具有最低的细胞凋亡率（图2B）。 图2 CKI与单味中药注射液对癌细胞株作用的比较。 3. 通过CKI和单一注射液处理MDA-MB-231细胞后的转录组比较 为了阐明CKI中草药配伍性的分子机制，研究人员针对CKI和单一注射液处理MDA-MB-231细胞进行了转录组分析。结果显示，每个处理的三个重复聚在一起，不同处理间可以很清晰的分开。尽管CKI和苦参注射液之间有着相似的化学成分，但是在CKI中白土苓的加入与苦参处理的MDA-MB-231细胞相比较，其转录组水平发生改变。研究人员利用 edgeR来区分为处理组和不同注射液处理的差异表达基因，结果显示仅在白土苓处理的细胞中发现253个差异表达基因，这个数量远小于CKI和苦参注射液处理组。另外，他们通过CKI处理组与苦参处理组差异基因来鉴定白土苓在CKI中所发挥的作用。 为了验证转录组分析结果的可靠性，他们针对已知的对CKI的有重要影响的几个基因TP53, CYD1A1, 和CCND1进行定量PCR验证。它们的表达水平的变化进一步证实了总RNA测序结果中苦参和白土苓相互作用结果的可靠性。 4. CKI和苦参注射液对MDA-MB-231细胞的相似作用 由于苦参被认为是CKI中的原生活性草药，同时研究人员也发现CKI和苦参之间相较于CKI和白土苓之间具有更多共同的差异基因，他们首先对CKI和苦参之间重叠的差异表达基因进行了统计分析。其中苦参处理细胞与未处理细胞相比较，共有2520个差异表达基因，而CKI为3236个差异表达基因。通过对这两组差异表达基因进行比较，最终发现有2039个基因为两组的重叠部分，这表明苦参在CKI中发挥着主要的作用。 为了更好的了解苦参和CKI共同差异表达基因的功能，研究人员运用GO富集和KEGG通路对这2039个基因进行分析（图3B,C）。结果表明，苦参和CKI处理的细胞中细胞周期和DNA复制相关的通路均有明显的下调作用。结合作者前面的报道，这些通路和注释分类的扰乱调节与观察到的CKI能够影响癌细胞的细胞活力和凋亡密切相关。其他注释分类主要为代谢过程和细胞迁移，如“嘧啶代谢”、“类固醇生物合成”和“积极的运动调节”等的紊乱，这些现象也在作者前面的研究CKI的作用中提到过。总之，这些结果表明苦参对CKI处理的主要分子机理具有非常重要的作用，能够使大多数CKI所干扰的细胞生物功能进行紊乱，导致癌细胞活力降低和细胞凋亡的增加。 图3 苦参（2mg/ml）和CKI（2mg/ml）处理细胞中共有的显著差异表达基因及其功能富集分析。 5. CKI和单一注射液对MDA-MB-231的不同作用 尽管上述富集结果显示苦参和CKI主要调节相同的通路，但是他们并没有具体表明这些扰乱发生的大小和方向。因此，研究人员进行了信号通路影响分析（SPIA），用来比较不同处理之间的显著干扰的功能性通路。有92条通路被CKI显著干扰，其中只有30条被激活。苦参和白土苓中激活/抑制的比率分别29/100和24/58。可以确定的是，白土苓能够扰乱更少的通路，但是其激活/抑制比率比苦参和CKI都要高。有趣的是，大多数通路被CKI和Kushen以相同的方式干扰（抑制或激活），如图4A，B所示，很少有通路显示不同的干扰方向。 苦参和CKI之间的相似效应也可以通过所干扰通路的高度相关性所发现，苦参和CKI的相关系数为0.83，而白土苓与CKI的相关系数为0.33。CKI对大多数通路也具有更强的干扰效应（图4C）。癌细胞中细胞毒性有关的通路中，如细胞周期、p53信号通路、癌症中的蛋白多糖和癌症相关通路，白土苓同样干扰了这些与苦参相同方向的通路，这似乎可以加强CKI中的这些效应。然而，细胞因子互作受体通路的变化显得十分有趣，与苦参注射液处理组相比，白土苓处理细胞会以相反的方式进行干扰，但是在CKI处理组中却没有显示出显著的干扰效果。将苦参和白土苓处理组在细胞因子互作受体通路出现的差异基因进行比较（图5），研究人员发现两种单一注射液处理后很多基因呈现相反的调节，例如CXC亚家族的基因和IL6/12样细胞因子和受体，这些都与SPIA结果一致。 图4 CKI和单一草药注射液对MDA-MB-231细胞的通路干扰分析。 图5 白土苓和苦参对细胞因子互作受体通路基因表达变化的比较。 6. CKI中白土苓的作用 为了研究CKI中白土苓的作用，研究人员比较了CKI处理和苦参处理的差异基因。结果仅发现有308个差异基因（图6A）。通过KEGG对这些基因分析发现，除了类固醇激素的生物合成和癌症转录失调外，所有其他途径都与免疫功能有关，并且大多数该类基因都是表达上调的（图6B）。这些结果也与 SPIA分析结果相一致，白土苓倾向于激活免疫相关通路。这类基因主要富集在干扰素γ产生、器官或组织特异性免疫反应和白细胞介素-2产生等，以及仅包含上调差异基因的免疫功能相关的各个方面（图6C）。与苦参相比，苦参和CKI之间的共同组基因（图6A）主要通过苦参处理而改变，然后与白土苓（107个基因）结合后进一步发生显著调节。在这组基因中，仅有三条通路（IL-17信号、沙门氏菌感染和类固醇激素生物合成）的基因发生过表达，这说明白土苓能够改变CKI中苦参上调免疫系统相关和激素相关的功能。另外，与苦参处理组相比，白土苓和CKI中都出现了24个基因（图6A），这可以视作白土苓对CKI效应的直接贡献部分。对该基因组中已知蛋白质间相互作用的分析，确定了IL-1家族和已知的调节免疫功能的互作蛋白（图7A）。为了验证IL-1蛋白水平也如预测的那样发生了变化，研究人员进行了ELISA检测，用以检测不同处理下的IL-1β的表达水平。他们可以证明，与未处理组相比较，CKI处理组中IL-1β的水平的增加主要与白土苓的作用有关（图7B）。综上所述，这些结果表明，白土苓主要通过改变与免疫系统相关的功能来促进CKI的作用。 图6 白土苓对MDA-MB-231细胞系调控的差异基因及其功能富集分析。 图7 白介素-1β表达变化的验证。 结论 在研究人员利用转录组分析，通过比较单一中药提取物在混合提取物中的作用，明确了苦参和白土苓在CKI中的配伍性。借此方式，他们解释了CKI在MDA-MB-231细胞中各种不同作用的来源。此外，研究人员还发现，白土苓能增强CKI中苦参降低细胞活力和加快细胞凋亡的作用。这些结果不仅阐明了苦参与白土苓配伍的中医理论基础，而且给出了一种可以应用转录组分析来研究中药配伍性的可行性方法。 评论 中药讲究配伍。配伍主要是根据中药性能的不同,有选择地将两种以上的药物结合在一起使用,达到增效或抵消副作用的目的。但是我们却很难去解释其原理，这也造成中药在西方社会很难应用和推广。本文作者试图利用转录组分析方法来解释复方苦参注射液（CKI）中两种植物提取物（苦参和白土苓）联合应用的效果及相互作用的分子机理。通过分析，作者发现苦参在CKI中发挥着最主要的功能，包括大部分的细胞毒性和癌相关通路的扰乱作用。同时，白土苓的存在不仅可以增强CKI中苦参的细胞毒性作用，还能够激活免疫相关通路。本文的意义在于作者不仅证明了苦参与白土苓配伍的分子机理，还为以后的中药配伍机理的研究提供了一种全新的思路。 更多推荐 1 科研 | 基于转录组和调控网络分析揭示了石斛降血糖作用及其机制（国人二区作品）
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