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编译：奶咖，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 二氧化氮（NO2）是空气污染的主要成分，已被纳入多种污染物的健康指数。研究发现生命早期暴露于空气污染与儿童神经发育障碍有关，暴露时间和胎儿性别可能在这些关联中起重要作用。出生前和新生儿暴露于NO2相关的空气污染中，会增加多种认知损害的风险，包括自闭症谱系障碍、注意力功能受损、智力发育迟缓和认知缺陷。产前暴露于NO2可能是儿童不良神经系统结局的危险因素。尽管大量的人类和动物数据已经证明了大脑发育的可塑性及其对环境变化的关键响应能，但有关怀孕期间NO2暴露影响的信息很少评估神经发育改变和功能缺陷的进展。本研究将怀孕的C57BL / 6小鼠暴露于NO2，以解决以下问题：（1）在没有出生后NO2暴露的情况下，断奶后代是否发生神经功能障碍？（2）出生前的NO2暴露如何影响出生后发育窗口期间大脑皮质的基因转录？本研究发现产前暴露的二氧化氮与性别相关的神经认知缺陷和产前暴露的后代皮层皮质转录组谱变化有关；男性特有的神经功能障碍与产后神经发育过程中基因的不断变化及其中枢lncRNA的转录调控有关。 论文ID 原名：Prenatal NO2 exposure and neurodevelopmental disorders in offspring mice: Transcriptomics reveals sex-dependent changes in cerebral gene expression 译名：子代小鼠的产前NO2暴露和神经发育异常：转录组学揭示了大脑基因表达的性别依赖性变化 期刊：Environment International IF：7.943 发表时间：2020.3 通讯作者：桑楠 通讯作者单位：山西大学环境与资源学院 DOI号：10.1016/j.envint.2020.105659 实验设计 将雄性和雌性C57BL / 6小鼠（8-9周）置于12h光照/黑暗，恒温恒湿状态下的SPF房间中适应1周。适应期后，将160只雌性和80只雄性小鼠交配（每个笼子中两只雌性和一只雄性），配对3天。每天早晨检查阴道，如果发现阴道栓阳性，则将该事件计为妊娠第0天（GD 0）。在第4天早晨，将雄性动物移出，将每窝8头从GD 0到GD 17的雌性阴道栓阳性的雌性圈养。在GD 18（分娩前约1-2天），将妊娠小鼠圈养在分开的笼子直到后代断奶，并且所有后代在出生后均未接受过NO2暴露处理。 产前NO2暴露总共107只栓塞阳性小鼠被随机分为暴露于NO2的组（54只动物）或暴露于空气的组（53只动物），并暴露于NO2（2.5 ppm，5小时/天）或暴露于空气中（5 小时/天），从动态GD 0开始并持续整个妊娠。 出生时记录妊娠时间，产仔数和性别比。在出生后第1天（PND 1）上测量和调整后代的体重和全脑重量（每窝每性别1-2只幼崽），并根据其产仔大小进行调整。将NO2-和空气暴露组的幼崽分别放在PND 1、7、14和21天处死 ，并收集大脑皮质，立即浸入液氮中冷冻，然后在-80°C下储存直至使用。 2. 转录组测序 将皮层用于PND 1、7和21（3例/年龄/性别/组）的深度mRNA测序（mRNA-Seq），并对PND 1、7、14和21进行基因和蛋白质表达验证（8例/年龄/性别/团体）。此外，对存储的皮质进行PND 21（3例/年龄/性别/组）上的长时间非编码RNA测序（lncRNA-Seq），并在PND 1、7、14和21（8例/年龄）上确认基因表达。共表达分析为了研究mRNA和lncRNA的共表达，计算了PND 21大脑皮层中每个显著变化的lncRNA和mRNA对的皮尔逊相关系数（PCC）。PCC <-0.9或> 0.9且经FDR调整的p值<0.01被认为具有统计学意义。GO功能注释和KEGG途径分析为了评估生物学功能。 3. 验证实验 ①空间学习和记忆测试。后代小鼠PND 21与母亲分开，每笼不超过10只，公母分开。然后，PND 22，选择小鼠（20仔/年龄/性别/组）进行空间学习和记忆测试。莫里斯水迷宫（MWM）使用MWM任务评估了空间学习和记忆。 ②样本实验。实时定量RT-PCR（qRT-PCR）；染色质免疫沉淀（ChIP）实验；RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）；免疫印迹分析。 结果 1 产前NO2暴露对妊娠参数、后代体重和脑重的影响 NO2组和空气组的妊娠时间、平均窝产仔数、性别比均未观察到显着差异（图1A）。产前NO2暴露可显著降低PND 1幼崽的体重（图1B）。但是，PND 1后代的脑重量没有显著差异（图1C）。后代均无死亡。 2 空间学习和记忆表现 首先，研究者要确定产前是否暴露于NO2，与认知障碍有无关联。为了解决这个问题，对断奶的后代进行了训练，以执行MWM任务，并测试了空间学习和记忆能力。产前暴露于NO2的雄性后代，而不是产前暴露于NO2的雌性后代：在训练的第2、4和5天表现出明显更长的潜伏期（图2A）；第2天和第5天的游泳距离更长（图2B）； 第5天有更多的趋轴性（图2C）； 与第1天到第5天（图2D）相比，相应的控件在等待时间方面的改善较小。各性别的游泳速度均保持不变（图2E）。 图2 产前NO2暴露对雄性和雌性后代学习能力的影响。 3 子代产后神经发育的lncRNA和mRNA表达谱 为了阐明可能的基因调控，以改变产后NO2暴露后代的空间学习和记忆能力，我们进行了转录谱分析，以确定雄性和雌性幼崽大脑皮层的mRNA表达在出生后第1、7和21天的差异。孕期吸入NO2导致后代中表达了许多差异表达基因（DEG），而雌性之间DEG的相似性很低（PND1上只有4个基因）（ 图4A和B，表1）。此外，产后发育过程中，雄性和雌性后代中DEG的数量均下降。通过分析雄性和雌性后代在PND 1、7和21上的DEG重叠，发现雄性有14个基因（8个已知和6个新奇）和雌性有2个基因（1个已知和1个新奇） 在整个产后期间持续变化（图4C和D，表S2和S3）。为了进一步确定DEG在雄性和雌性后代中的生物学功能，进行了GO分析（图5）。 图4 对PND 1、7和21的雄性和雌性后代大脑皮层中产前NO2暴露作出响应的基因表达的mRNA-seq分析。 为了确定lncRNAs是否与mRNA表达有关，以响应于产前NO2暴露而改变后代的空间学习和记忆性能，我们在PND 21的雄性和雌性后代大脑皮层中进行了lncRNA分析，鉴定出660个lncRNA，其中451个分别在雄性和雌性后代中显着和差异表达（上调p<0.05）（图6A）。为了进一步研究这些lncRNA在改变的基因表达以及空间学习和记忆中的作用，在断奶的雄性和雌性中鉴定了900和198个显著共表达的lncRNA-mRNA对（p <0.01，Excel文件表S3和S4）。随后，研究者根据KEGG途径对lncRNA的共表达mRNA进行注释，预测了lncRNA的潜在功能，并发现阿尔茨海默氏病疾病（AD）（mmu05010）和氧化磷酸化（mmu00190）是产前暴露于NO2的雄性后代中激活的最具代表性的生物功能途径（图6B），而在雌性后代中则无。 图6 出生21天雄性和雌性后代大脑皮质中lncRNA表达对产前NO2暴露的响应。 4 雄性后代中lncRNA的转录调控 考虑到雄性中lncRNA的显著改变与AD途径高度相关，而ApoE是AD注明该的致病基因，在产前吸入NO2后持续变化（表S2），我们确定ApoE是导致雄性小鼠独特的空间学习和记忆力下降的关键基因之一。qRT-PCR和免疫印迹验证表明，暴露于NO2的雄性幼崽在PND 1、7、14和21时期ApoE显著上调（图7A和B）。基于qRT-PCR验证，暴露于NO2的雄性幼崽中，Malat1在PND 1、7、14和21时期的表达显著增加，比暴露在空气中的雄性幼崽的Malat1表达高1.39-，1.32-，1.24-和1.29倍（图7C）。Malat1可能通过调节基因表达并通过与转录因子如NF-κB相互作用激活信号通路来发挥其功能。ChIP分析证实了ApoE基因启动子区域中存在NF-κB结合位点，最重要的是，产前NO2暴露显著促进了NF-κB与ApoE基因启动子区域的结合（图7D）。最后，RIP实验证实了NF-κB是一种与Malat1相互作用的蛋白，产前暴露显著增加了雄性后代大脑皮层中Malat1-NF-κB的相互作用（图7E）。 讨论 先前的流行病学研究报告了孕妇在妊娠期间接触NO2与胎儿生长之间的关联。本研究发现暴露于产前NO2会显著降低PND 1的后代体重。此外，我们调查了整个孕育期暴露于NO2的后代神经发育情况（从PND 1至21）。 水迷宫测试观察到雄性后代而非雌性后代在空间学习和记忆性能上的显著改变。首先，在MWM的隐藏平台任务中，所有后代都表现出学习能力，逃避潜伏期和路径长度逐渐下降。但是，只有产前暴露于NO2的男性表现出潜伏期的减少。妊娠NO2暴露会导致出生第21天的雄性特异性神经认知功能障碍。由于认知缺陷在许多神经发育疾病中很常见，并且伴随基因表达的改变，因此产前吸入NO2可能会损害关键神经发育过程的基因表达，从而影响疾病的病理生理。 本研究通过对雄性和雌性后代大脑皮层的转录组表达谱进行分析，表明怀孕期间吸入NO2会导致产后子代产生大量DEG（包括mRNA和lncRNA），有明确的性别特异性毒物基因组反应。GO分析显示，雄性子代DEG集中在调节重要的神经发育过程的功能类别上，例如神经发生、神经元迁移、神经元分化、轴突发生、轴突引导、基于微管的过程、谷氨酸能突触途径、神经胶质细胞增殖和神经胶质细胞发育。考虑到所有这些生物过程在大脑发育和神经认知功能的建立中都起着关键作用，并且大多数复杂的人类神经发育障碍——智力障碍（ID）、自闭症谱系障碍（ASD）、注意力缺陷多动障碍（ADHD）和精神分裂症等，本研究表明从出生第1天到21天的基因动态变化可能是导致雄性后期认知缺陷的原因之一。 怀孕期间吸入NO2以时间依赖的方式影响涉及多个神经发育过程的大量mRNA。因此，鉴定持续变化的基因可以指导阐明产前NO2吸入后雄性子代特异性认知功能障碍病理的分子过程。本研究发现从出生第1天到21天，雄性中只有14个DEG和雌性中有2个DEG在不同时期均有显著差异。本研究专注于与空间学习和记忆相关的基因ApoE，ApoE在雄性中的持续表达和特异性表达高于雌性。ApoE在大脑发育过程中和损伤后均在髓鞘和轴突膜的修复、生长和维持中起着重要作用，并且对于神经元的生长和突触形成是必需的。GO分析显示，ApoE与脂质转运和胆固醇代谢功能有关，而且还参与了多个生物过程，例如对氧化应激、Aβ形成、cGMP生物合成过程和谷氨酸受体簇的响应等。由于这些生物过程参与控制脑微环境的动态平衡并部分调节突触可塑性，ApoE可能是影响雄性后代学习和发展的重要因素。因此，研究调节雄性后代中ApoE异常表达具有重要意义。 lncRNA是长度超过200个核苷酸的RNA转录物。与mRNA相比，lncRNA的很大一部分仅由两个外显子组成，缺乏明显的开放阅读框（ORF）且编码潜力低。通过表观遗传修饰和蛋白质编码基因表达的调控，lncRNA被认为是神经生物学过程（如神经发生、神经分化、神经元凋亡和突触功能）的关键调控因子。lncRNA的异常表达在各种神经发育疾病（包括发育迟缓，ASD，注意力缺陷障碍（ADD），ADHD，唐氏综合症，癫痫和ID）中起关键作用。本研究首次探索产前NO2暴露的子代小鼠，在出生第21天时lncRNA的变化，并分别鉴定了660和169个在雄性和雌性中受影响最严重的lncRNA，分别具有900和198个lncRNA-mRNA共表达对。重要的是，对于雄性子代，基于lncRNA共同表达的mRNA功能显著富集在AD和氧化磷酸化途径中（与空间学习和记忆有关），产前暴露于NO2可能会导致mRNA谱异常表达和神经功能障碍。 本研究着重研究lncRNA Malat1，不仅是因为它位于核斑点中，且在神经系统中高表达，还因为它有最多的lncRNA-mRNA对，在暴露于NO2的雄性后代中显著上调，影响产后神经发育过程。最近，已证明Malat1在应激反应、大脑发育、功能多样化和神经退行性疾病中起重要作用。在神经元细胞中，Malat1调节与神经突生长和突触发生有关的基因的表达。空气污染吸入在暴露的动物大脑中引起的神经炎症反应与NF-κB的激活有关。NF-κB被认为是一种免疫转录因子，参与了炎症细胞的活化以及多种细胞因子和趋化因子的基因表达调控。响应细胞因子或神经元损伤而激活的NF-κB引起ApoE表达和释放的升高。值得注意的是，本研究表明Malat1介导产前NO2吸入组雄性后代中的异常ApoE转录物与NF-κB信号相关。 评论 本研究探究了子代小鼠不同发育时期大脑皮层的转录组表达谱，并测试了其在断奶期的认知功能，孕期暴露于NO2组的子代中观察到了性别相关的变化以及雄性特异性学习和记忆的障碍。lncRNA Malat1表达升高，通过NF-κB激活调节ApoE表达。尽管其他因素也可导致暴露于NO2的后代，具有性别依赖性的认知表型，但本研究为出生前NO2暴露对神经发育的影响提供了基因组证据，并在分子水平提供了重要的机制信息以进行诊断和治疗。 更多推荐 1 科研 | 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