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编译：KT!，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine. 译名：单细胞RNA测序在心血管发育、疾病及心血管医学中的应用 期刊：Nature Reviews Cardiology 发表时间：2020.03.30线上发表 影响因子：17.42（2018年） 通讯作者：David T. Paik 通讯作者单位：美国加利福尼亚州斯坦福市斯坦福心血管研究所，斯坦福大学 DOI号：10.1038/s41569-020-0359-y 背景介绍 传统的基因表达分析技术比如定量PCR、基因芯片和bulk RNA测序技术，可以同时处理成千上万的基因，最终得到的是它们的平均值。但是没有任何两个细胞或者不同状态的细胞在基因表达水平会完全一样。在多种细胞类型组成的样本分析中，通过表面-膜蛋白标志物识别的靶细胞群优先以荧光激活或者共轭磁珠交联的方式分类出来进一步单独分析。这种方式虽然能够有重要发现，但昂贵、耗时费力，不能够完全识别细胞异质性，而且遗留未分类的细胞类群。而scRNA-seq技术克服了这种缺陷，能够实现对给定样本在转录水平上高辨识度和深度的分析。总之，scRNA-seq可以精准评估细胞异质性，发现新的细胞类型和细胞状态，阐明在细胞发育和分化过程中的动态变化（图1、2）。这为scRNA-seq技术在心血管研究领域的应用奠定了基础。 scRNA-seq 在心血管研究方面的应用范围很广(图2)，除了对罕见细胞群的识别外，还能够在细胞转录水平基础上分析细胞轨迹，从而准确阐明在细胞发育和干细胞或者祖细胞分化过程中的细胞转变情况。此外，scRNA-seq技术可以分析成年小鼠和人类胎儿中包括心脏和冠脉血管组织的转录组学和表观遗传图谱，正是各种细胞类型的转录组特征奠定了器官和组织特异性的功能。同时，鉴于scRNA-seq技术的单细胞分析特点，这种技术也能够在基因表达的基础上预测细胞间联系。这种分析技术希望能够在未来通过空间转录组学的发展得到完善， 主要是在固定的渗透性的组织段中应用带有空间条形码引物的RNA-seq,从而在已知组织坐标轴中绘制转录组信息。这种单细胞基因组学、转录组学、表观遗传学和蛋白质组学的结合将会对细胞群异质性的评估上起到关键的作用，同时对于个体特异性的药物应答和副作用的分析中也是非常重要的。scRNA-seq 在心血管研究方面的应用如图2所示： 在这篇综述中，研究者探索了实验工作流和scRNA-seq 的应用，讨论了相关的数据分析策略，总结了在心血管研究中scRNA-seq 的应用。而且还描述了融入多模态单细胞组学平台的潜在作用，这扩大了对心血管领域的认知，促进了心血管精准医学的发展。 主要内容 1. 实验流程： 单细胞RNA测序技术的实验流一般如下： 图1单细胞RNA测序工作流程。 1）样本准备：从待测器官或者组织中分离单细胞，尽可能获得最多的细胞数量和最高的细胞质量，即消化细胞的时间尽可能最小，细胞死亡数最少；样本准备受到很多因素的影响，比如组织或者细胞类型、培养条件（悬浮物或附着物）、细胞外基质成分和细胞变异度等等，致密组织或3维器官模型一般采用酶解加上机械搅拌的方式，蛋白水解酶的选择也很多，同时应严格掌控消化时间。 表1：常见的scRNA-seq技术的不同特点的比较：主要的测序方法分为两类， 基于full length和基于unique molecular identifiers (UMIs)的测序方案，后者可分为偏好3′端和偏好5′端的测序技术。单细胞RNA研究中考虑的三个主要问题是：1）full length 还是UMI 2）cell number细胞数；3）sequencing reads number测序读数。其主要是根据研究目的而定。偏向于要测大量细胞>10,000的细胞图谱类的研究常采用UMI的方法(drop-seq)，其提供的信息基本足够对细胞分类或者鉴定细胞标志物。对于需要获得更多生物信息的研究，如lncRNA、miRAN和可变剪接（Alternative Splice）等，则采用smart-seq2的全长模式，测序深度更高。对于各种测序技术的优劣评估主要包括基因数目或者细胞数、准确度评估、 drop out效应、扩增干扰度、成本以及采用的单细胞捕获方法等。 2）单细胞采集：采用多种单采方法获得独立互不连接的单细胞。一些高通量的技术，比如最常用的荧光激活细胞分选（FACS），可根据细胞的大小/形状或细胞表面标志物的表达进行有偏向的选择，而基于微流体和液滴的技术可实现细胞的无偏向分离，如Fluidigm C1和10x Genomics Chromium系统。 3）单细胞RNA反转录和PCR扩增。 4）文库构建。 5）测序：二代测序技术，并对数据进行质量控制和标准化处理以及降维处理以实现数据可视化效应。 6）数据分析：包括细胞亚群聚类分析、线性重建以及细胞间联系的预测。 图3：细胞亚群聚类方法比较，其测序数据在图中表现为圆圈型（左上角）、线性（右上角）、杂乱型（左下角）和曲线型（右下角）。颜色代表由不同聚类方法识别的类群；同一个数据集的类群可根据不同的聚类方法而变化，图中依次是原始类群（a）、等级聚类（欧式距离）(b)、等级聚类（Canberra距离）(c)、K-法(d)、图聚类中的Louvain算法（20 NN）(e)和Louvain算法（40 NN）(f)。本研究的模拟聚类中，等级聚类分析的Canberra距离错误地将杂乱型再分并合并为两个不同地类群。K-法将线性轨迹类群和曲线型上升部分统一化是不恰当的；Louvain由于设置的NN值不足导致将一个大规模的类群划分为几个亚群，当调整合适的NN值后才出现正确的类群。因此，通用的最优聚类方法是不存在的，因为不同的数据类型本质上具有唯一的类群模式，比如轨迹形状、复杂程度以及干扰度。一般来说图聚类法原则上是最佳的表现形式，但其它聚类方式仍应该作为比较分析，同时，对所得结果进行生物学验证也是必要的。 心血管细胞图谱的构建心脏发育scRNA-seq 已用于分析心血管系统的各种组织和细胞类型如表2。例2016年，两个团队使用scRNA-seq技术对胚胎心脏的解剖定义区域分析，独立生成了不同发育阶段所有主要心脏细胞类型的单细胞图谱。Li等人使用随机森林算法分析了胚胎8.5-10.5天的小鼠心脏的转录特征，并能够以91%的精度预测单个心肌细胞在发育过程中的解剖位置，包括由Isl1，也称为胰岛素基因增强蛋白标记的谱系。Delaughter等人采用类似方法，分析了胚胎9.5天到产后第21天的心脏细胞，揭示了胚胎和产后成熟阶段特定的心肌细胞转录特征。这两项研究都发现，同源异型盒蛋白Nkx-2.5缺乏会导致心肌细胞成熟障碍，并描述了胚胎发育过程中心脏细胞类型的大量异质性。 图2：scrNa-seq在心血管研究中的应用 scRNA-seq也用来识别和调控心脏早期发育阶段谱系演变的机制。如研究发现，mesp-1在祖细胞向心脏分化过程中是必要的，Nkx2-5+/-间接决定了CPCs的命运，IslI+/+是细胞呈现多向分化状态的刺激因子，后两者在CPCs和终分化细胞间的联系与区别中起着重要作用；Hand2是流出道细胞的标志性分子而非右室细胞，scRNA-seq技术分析发现流出道心肌功能的缺陷，是导致先天性心脏病的原因，而不是右室心肌。 表2：发育阶段：embryonic：胚胎期；Adult 成年期；Larval 幼虫期；species 种类包括小鼠、人类、斑马鱼、秀丽隐杆虫；研究的疾病有先天性心脏病、小儿线粒体心肌病、缺血-再灌注、心肌梗死、心碎综合征、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化以及主动脉缩窄；单细胞采集和scRNA-seq方法如上所述；GFP, 绿色荧光蛋白; ISL1, islet 1; NA ,未应用; rtTA , 反式四环素调控的反式激活蛋白； 成人心脏稳态和疾病单细胞转录组可以用来区分成人小鼠心脏的细胞亚群。对健康成年小鼠的心脏非心肌细胞的scRNA-seq发现了参与维持心脏稳态的细胞如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞之间的联系网络，此外，基因表达的细胞类型特异性以及性别特异性的差别也参与心脏稳态的建立。目前，已有众多研究在成人小鼠心脏或者心脏病模型中采用各种不同的scRNA-seq技术在已知细胞类型基础上发现了各种细胞亚群，并对细胞内轨迹进行了进一步的分析。比如对心肌梗死后小鼠的新形成内皮细胞异质性的分析的研究说明scRNA-seq技术已致力于对非心肌细胞亚群形成的心脏微环境变化的分析。 scRNA-seq技术也应用在心脏发育过程中细胞基因表达的分析中，高通量测序发现心肌细胞和成纤维细胞在心脏发育中的基因表达呈逐渐变化的状态，此外基因表达情况也呈现种间相似性和差异性。 血管和造血细胞冠脉血管的形成在心脏发育过程中是一种高度动态变化和有序的过程。动脉和静脉的形成受到转录组的调控，呈相互对立的状态，但是在发育中通过细胞命运的转换一些先存静脉也可以形成新生动脉，而scRNA-seq技术在阐释血管发育过程中细胞命运转换中起着重要作用。研究发现，冠脉是由一种来源于静脉细胞的前动脉群形成，其中静脉细胞在发育中发生了细胞命运的转换，向着动脉细胞表型的方向发育，从而形成了动脉血管。其中，COUP-TF2因子在这种命运转换中则发挥了关键调控作用。 scRNA-seq可以在一些血管疾病中区分细胞状态以及命运决定。如粥样硬化动脉中的VSMCs可以向纤维样细胞类型转换，在粥样硬化血管中存在组织变异体决定其分化状态。此外，免疫细胞如巨噬细胞和髓样细胞亚群的集合体也参与粥样硬化血管的形成。 器官图谱scRNA-seq技术可以实现对各种不同器官的所有组成细胞的图谱分析。例，一项研究对61只小鼠从胚胎期9.5天到13.5天的2千万个细胞的发育轨迹进行分析；另一项研究对20只成年小鼠的10万个细胞进行基因表达差异性的分析，通过分析细胞酶解图谱和细胞表面标志物蛋白更利于细胞的分离和提取。此外，已有机构联盟绘制人类细胞图谱，主要针对成人自然衰老心脏或者疾病心脏的所有细胞类型中的变化特征进行分析如图4。 图4：成人心脏的单细胞鉴定：a:单细胞测序分析成人自然衰老或者合并疾病如结构性心脏病和缺血性心肌病的组织发育变化特征；b：采用scRNA-seq技术对成人心脏的所有细胞类型及逆行分析，包括室特异性心肌细胞、构成传导系统的节细胞、冠脉血管或微血管的血管和免疫细胞、基质细胞如成纤维细胞、瓣膜壁上皮细胞，以及罕见的细胞群如黑色素细胞、神经元细胞或心脏干细胞或祖细胞。 多能干细胞模型scRNA-seq技术在解决多能干细胞模型的不成熟、异质性等问题上发挥了重要作用，应用scRNA-seq探索在转录后水平调控细胞分化的信号通路，识别分化的所有细胞类型以及优化修饰操作步骤以获得心血管细胞的特殊类型。 表3：多能干细胞模型的scRNA-seq研究 iPSC-CMs (多能干细胞来源的心肌细胞)在各种生理特性上呈现胎儿样特征。多项研究表明，心脏转录调控子可以分析鉴定iPSC-CMs的异质性本质。如，采用scRNA-seq技术测定iPSC-CMs不同阶段约4万个细胞发现非-DNA结合同源域HOPX会导致其持续不成熟状态。表达COUP-TF2和TBX5的iPSC-CMs表现出更加成熟的特质并呈现心房样特征，而表达HEY2和IRX4、肌球蛋白调控轻链2、MYL2的iPSC-CMs则呈现心室样的特征。 iPSC-ECs(多能干细胞来源的内皮细胞)应用于血管疾病或者血管功能紊乱的遗传和环境因素的影响等方面的研究中。但其缺点是细胞的不成熟以及异质性。研究证明，利用基于液滴的scRNA-seq可以识别4种iPSC-ECs亚群的表面标志物，如CLDN5、GJA5、APLNR、APLNR分别是代谢活跃细胞、心房样细胞、炎症应答、活化细胞的标志物。 单细胞多组学方法组合标引组合单细胞技术除了scRNA-seq技术，单细胞组学技术如单细胞染色质开放技术（scATAC-seq）、DNA甲基化组学、蛋白质组学等携带scRNA-seq技术所不能完全采集的信息。如图5： 图5：心血管精准治疗的单细胞多组学方法： scRNA-seq已被有效应用于识别新的或罕见的细胞群，确认感兴趣的组织或器官的细胞异质性，并构建发育或分化过程的细胞轨迹。其他大分子的单细胞分析技术日益提高，结合单细胞多组学方法，进一步推进了心血管精密医学。除了单细胞基因组学和转录组，单细胞染色质开放性、DNA甲基组和蛋白质组学呈现了特有的细胞异质性，能够更好地预测心血管药物和疗法的个体特异性反应。CITE-seq：转录组和表位的细胞索引测序；iPSC：诱导型多能干细胞；LC-MS/MS：液相色谱-串联质谱法；scATAC-seq：单细胞染色质开放性测序技术；WES：全外显子组测序；WGS：全基因组测序； scATAC-seq技术可以同时检测数以万计的细胞的染色质可开放区域，并识别转录水平的调控元素。该技术已应用于果蝇胚胎形成、人类造血系统和T细胞受体特异性等方面。但scATAC-seq需要单独分离细胞核，由于核膜的脆弱性和半渗透性，在离心和悬浮期间需要非常小心。 DNA甲基化也可以分析所有细胞的分化潜能以及转录活性，这种方式不通过RNA表达的参与。部分研究结合scRNA-seq技术或者染色质开放技术对表观遗传调控和转录调控的机制进行分析。但是这些调控过程如何操纵下游细胞表型和行为状态目前仍然未知。我们的技术瓶颈在于寻找一种单细胞方法能够集聚灵敏性和输出量的优点来探索细胞蛋白质组学。 利用寡核苷酸-偶联抗体，如CITE-seq或TotalSeq，开发出了允许同时分析单细胞转录组和数十种蛋白质的集成方法，但这些方法目前仅限于少数表面蛋白质，并依赖于定制设计的抗体的可用性。因此，优化工作流程对于单细胞分辨率下实现真正全面的多组学分析可能至关重要，这种方法可以将上游基因调控机制与蛋白质水平的下游表型相联系。 空间转录组学的发展提高了单细胞空间分辨率。如编码的寡聚-dT微阵列、Slide-seq技术等，Asp等人通过整合空间转录组、scRNA-seq和原位测序，生成了人类心脏发育前三个月的时空地图，创建了3D空间细胞图。其他组学技术类似方法（如染色质开放性）的开发，为高维多组学分析打开大门，具有可追踪到单个细胞的本地化坐标。 心血管精准医学医疗卫生事业目前最大的挑战便是治疗的异质性效应。市场上存在0-90%的药物对于超半数的患者无效。其个体特异性药物应答的潜在原因可能是遗传和环境共同作用的结果。其中，细胞与细胞之间的异质性可能参与到药物应答的过程，因此，单细胞技术对于精准医学的发展起到了重要的作用。scRNA-seq在临床方面的应用主要在癌症方向，如原发性肾脏肿瘤和肺转移的治疗采用针对这两种通路的方法比起单细胞治疗的效果更好。有研究显示，非恶性肿瘤相关细胞如基质细胞或免疫细胞对于肿瘤的进展和维持起到了关键作用。构成肿瘤组织的细胞成分在不同患者之间也是不一样的，这对疾病的诊断和治疗应答具有指导作用。比如，对于心血管疾病药物治疗通常是次优选择，因为存在患者特异性药物应答。此外，一项来自于不同个体的多能干细胞来源的心肌细胞的混池转录组图谱分析发现了对于常见心血管药物应答的细胞间和分子间的差异。通过单细胞组学技术可以检测到这种个体特异性的细胞间异质性。 同scRNA-seq生成的细胞图集，心脏和周围血管由多种细胞类型组成，包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、VSMC、瓣膜间质细胞和免疫细胞，每个细胞都可以进一步分类为亚型。不同细胞类型（尤其是非肌细胞）对心脏发育、平衡和疾病的功能贡献日益受到重视，这促使近年来单细胞研究数量迅速增加，重点是各种心血管疾病环境中的新细胞数量和亚型。但是，与癌症一样，个体之间心血管细胞群体的组成和行为也有很大差异，这很可能导致对治疗的反应不一致。 未来解决这些挑战的一种方法是在临床干预之前创建针对患者的细胞图谱。 可以想象，基于scRNA-seq的细胞数量、基因表达谱和细胞异质性评估将补充现有的诊断测试，并告知医生确定最有效，个性化的治疗选择。以前使用scRNA-seq发现的患者血浆生物标志物谱分析，或在某些罕见情况下，通过活检或子宫肌瘤切除术获得的患者心脏样品的直接图谱分析，原则上可用于监测疾病状态并选择最佳治疗时间点。在某些情况下，异常的免疫细胞或升高的细胞因子表达可能会鼓励与免疫调节药物共同治疗，以限制干预后长期的炎症。鉴于其高灵敏度，scRNA-seq在临床上也可用于检测与疾病相关的稀有细胞，从而可以更有效地靶向输送药物。 尽管有这些潜在的好处，但在临床上常规实施scRNA-seq之前，必须克服许多技术、计算和财务方面的障碍。鉴于其固有的复杂性，scRNA-seq可能无法作为用于治疗决策的独立技术，并且其未来整合到临床环境中可能需要进一步开发组合测定法和并行诊断测试。鉴于scRNA-seq技术仅在最初的几次迭代中就获得了发展势头，这些挑战可能会得到解决。随着scRNA-seq技术的不断改进，测序成本的降低以及数据驱动的精密医学的发展，单细胞应用将继续增长，并且将来很有可能重新定义患者的治疗方式。 结论 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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