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编译：小北，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读
成年人的造血干细胞（HSCs）被认为是从胚胎妊娠中期的血源性内皮细胞（HECs）获得的，由于稀少和短暂存在的特性，含HSCs的HECs尚未被严格定义和准确捕获，更不用说它们真正的血管前体了。本研究作者首次利用高精度的单细胞转录组技术在持续的发育阶段胚胎日（E）9.5～E11.0，间隔0.5天无差别检测了相对的EC细胞群体。研究者从转录水平在主动脉-性腺-肾（AGM）区的背主动脉鉴定了两组不同分子量的动脉EC细胞和公认的峰值在E10.0的HSC的前体HEC。经过计算机预测以及体内功能鉴定，研究者通过新构建的Neurl3-EGFP报告小鼠模型准确的捕获了含HSCs的HECs，并且通过表面的标记物Procr+Kit+CD44+, PK44进一步做了相关富集分析。惊奇的发现内皮-造血双重的潜能不仅少而且依赖于单个HECs的培养，而且原始血管内皮细胞经历E8.0两步命运抉择成为含HSC的HEC，即最初的动脉命运选择以及随后的血源性转归。这些发现也解决了之前观察到的矛盾。总之，对于体内内皮细胞进化以及含HSC的HEC分子程序的综合理解有助于促进体外对HSC群体的未来研究。原名：Embryonic endothelial evolution towards first hematopoietic stem cells revealed by single-cell transcriptomic and functional analyses 译名：通过单细胞转录组和功能分析揭示了胚胎内皮细胞向第一个造血干细胞的进化 期刊：Cell Research 影响因子：8.58 发表时间：2020年3月20日 作者：刘兵、汤富酬、兰雨 单位：再生医学血液学研究所、第五医学中心实验血液学重点实验室、广州再生医学与健康广东省实验室、北京大学、暨南大学等 DOI：10.1038/s41422-020-0300-2 成年人的造血系统主要由HSCs以及多个种系的后代组成，被认为是从胚胎妊娠中期的HECs中获得的。被广泛认可的是当仍然停留嵌在内皮层或者表现出内皮细胞特征时，HECs开始表达关键的血源性转录因子Runx1，表现出造血潜能。与造血祖细胞不同的是HECs缺乏造血表面的标记物例如CD41和CD45，这两类因子在直接检测克隆形成单元实验中可用于标记能产生造血祖细胞的群体。干细胞及源祖细胞（HSPCs）从主动脉内皮细胞（ECs）产生，通过一个短暂变化的内皮-造血功能的转换形成主动脉内的造血簇（IAHCs）。定位在IAHCs或者更深的内皮下层，HSCs的前体被认为是HECs和HSCs之间的关键中间调节因子，具有可诱导的再增生能力和造血表面标志物活化能力。含HSC的HECs是血管ECs细胞决定HSC命运的起始也是最重要的步骤之一。然而，对于含HSC的HECs细胞的准确定义尚不明确，同时对于是否原生的或者动脉ECs是含HSC的HECs细胞的主要来源，这一矛盾观念尚存争议。有报道称HECs和动脉中的ECs代表不同的种系。HSCs和动脉中的ECs是从不同的祖细胞产生的，有不同的Notch信号通路的强度。最近的报道通过转录组发现含HSC的HECs具有明确的动脉性，这也提示了动脉EC的起源。为了进一步深入探究基于含HSC的HECs特异性以及HSPCs的细胞进化和分子，有效的分离含HSC的HECs是必需的，而这一步不仅由于群体数量少和存在短暂困难，还由于对于确定HSC的技术上存在挑战。考虑到在胚胎发育过程中不止HSCs还有短暂定义的造血细胞从HECs中分离出来，再增生能力是含HSC的HECs功能上进化所必需的。之前的研究报道只有在胚胎（E）10.5的AGM区域CD47− ECs以及E9.5的P-Sp区域Dll4+以及Dll4− ECs具有HSC的能力，但是这些表面的标记物富集远远没有效率。一些能够从非HECs中区分HECs的转基因报告小鼠模型已经建立，包括Ly6a-GFP、Runx1 +23GFP以及 Gfi1-Tomato，这些模型有效地解释了内皮-造血转变，尽管在一定程度上，含HSC的HECs并没有直接确定。目前为止，有效分离含HSC的HEC群体并未实现。基于揭示HSC出现的分子事件，近年来一些对HECs、IAHC细胞以及HSPCs在AGM区域单细胞转录图谱的研究已经报道，无论是应用Runx1 +23GFP还是Gfi1- Tomato作为HECs的标记物，一些细胞群体通过Fluidigm单细胞qPCR或者scRNA-seq的转录图谱确定。此外，IAHCs中的细胞组分在单细胞水平通过将动脉中的全部IAHCs挑选被研究，结果也显示含有HSC前体特征的细胞也主要参与其中。有趣的是，HECs和非HECs群体分子层面相似但是在一定程度是可区分的，这样的矛盾依然存在。定义HEC的标记物富集的有效性或者特异性还不够充分，在造血组织中对胚胎上皮非监督的绘制需要对含HSC的HECs准确的识别。考虑到大量可调度的资源，体内功能进化的便捷以及遗传操作的可行性，小鼠的胚胎对于发育事件是一个很好的模型（与人类胚胎相比），特别是像HECs这种稀少又存在短暂的细胞群体的发育。在本研究中，研究者首先利用高准确的单细胞转录组技术无差别的检测了发育所有时期包含含HSC的HECs特异性的各个时间点的EC细胞群体，从转录层面进行鉴定并且对标记物进行计算机绘制。通过结合表面标记物或者新构建荧光报告小鼠模型准确的捕获分离含HSC的HECs，研究者进一步揭示了最初在原生血管ECs中逐步具有造血功能所潜在的细胞进化和分子机制。一系列的新发现，包括HECs内皮-造血双重的潜能以及含HSC的HECs特异性的多个步骤，史无前例的拓展了对体内HSC生成的理解，对于HSC从多能干细胞产生新方法的研究至关重要。研究者首先分析了小鼠胚胎IAHC在主动脉开始形成的E9.5，一直到HSCs在E11.0形成的阶段。除了头、肢芽、心脏以及内脏芽，胚胎被完整的分离出来。为了特异性的捕获AGM区域主动脉腔的ECs，研究者对E10.0-E11.0的胚胎主动脉背侧进行了微量注射俄勒冈绿色荧光染料。样本细胞通过FACS被纯化为CD45−CD31+CD144+，该集簇主要是血管的ECs和CD41+造血细胞，同时CD45−CD31−CD144−的非ECs细胞被视为阴性对照（图1a）。研究者在单个细胞水平通过基于UMI的scRNA-seq准确的测量基因表达图谱发现，在662个测序的单细胞中有597个单细胞的转录组通过了严格的质检，在每个细胞中约平均有7035个基因（从2266到10843）以及636,418个转录本（从103,793到2,959,573）。依据Seurat软件进行的图聚类分析发现所有细胞被分成了六类：一类主要是非EC的阴性对照，另五类几乎包含所有FACS分离的样品细胞。CD45−的造血细胞（HC）中Runx1和Itga2b显著表达区分于另四类表现出动脉或静脉特征的血管EC簇（图1b、c）。静脉的EC簇依靠Nr2f2的独自表达在所有血管EC群体中被识别。两个动脉的EC簇Gja5的表达相似但是Ltbp4的表达不同。结合所有不同样本的阶段（主要从E9.5-E10.0和E10.5-E11.0）被注释成早期AEC和晚期AEC（图1b、c）。左边的集簇能够满足HEC的分子定义，在内皮特性的基础上Runx1的表达显著，被命名为HEC簇（图1b、c）。不同实验无分批效应，说明了本实验中scRNA-seq的高质量和可重复性。为了更严格的界定HEC群体。在对照组以及那些表达Ptprc（编码CD45）或者Spn（编码CD43）的转录组在下一步的研究中都被排除。由于HEC和另两组AEC簇在分子和空间层面更加接近备受关注（图1b、d）。为了进一步排除早期AEC簇中难以确定与造血特异相关的群体，研究者进一步在限定的群体中进行了聚类分析。造血特异的Runx1在两组中表达并无明显差异，这也说明了在我们的集簇中没有遗漏造血特异的群体。此外，在HEC的亚簇中没有差异表达的基因且无造血相关的特征。这也提示在HEC集簇中同源的特性。在E10.5期HEC群体迅速减低，并且很难在E11.0期被检测到。相较于早期AEC，HEC中的基因高表达并且晚期AEC的基因主要在细胞周期和核糖体生物合成中富集。细胞周期分析的结果也显示在HEC中显著活化，与动脉EC成熟的静止状态形成鲜明的对比。在HEC簇每个细胞中mRNA和核糖体基因的平均表达水平都比早期AEC或者晚期AEC高，进而支撑造血特异性过程中转录的整体上调水平，这也与人类胚胎在含HSC的HECs转录起始相较于动脉中的ECs广泛存在。研究者进一步评估了群体中动静脉的分值，并且在小鼠和人类发现HEC而不是造血群体显示特定的动脉特性这一相似的结果（图1h）。通过Monocle2的轨迹分析显示从早期AEC到晚期AEC沿着动脉成熟的轨迹，HEC从早期AEC的E9.5-E10.0被分离出来（图1i）。HEC特异性伪时间轴上，有逐步上调的造血基因如Runx1和Spi1，同时伴随逐步下调的内皮和动脉的基因，同时伴随代表动态持续过程的内皮-造血双重功能的HEC群体（图1j）。这一结果也与之前的报道HECs中相互表达的Runx1和Sox17一致。为了进一步探究抉择早期AEC不同命运的差异表达基因，研究者经过筛选发现了八大基因突变图谱（图1k）。大多数的基因沿着一个特异的通路可变表达。在这些组中大多数的转录因子无论是在HEC特异性或者动脉EC成熟过程中都是上调的（图1l）。有趣的是，Hoxa5和Hoxa9的表达与Runx1的图谱一致（图1l）。这些证据都提示早期AEC过程基因的表达都需要为接下来的细胞命运被准确地协调。AGM区域HSC以及内皮-造血双重潜能HECs的捕获研究者进一步结合HECs功能上的进化确定了表面标记物。通过分析Runx1表达相关群体的差异表达基因，Cd44、Procr以及Kit被筛选出（图2a）。在接下来功能分析的实验中为了与转录组分析一致研究者特异性的聚焦E10.0的胚胎。全贴片免疫染色的结果显示除了整个组织中的血细胞，在背主动脉整个内皮层CD44的表达，最接近分支（图2b），这也与之前的报道小鼠胚胎中动脉上皮中CD44的定位一致。应用相似的方法确定了前期HSC，研究者发现只有E9.5–E10.0胚胎中CD41−CD43−CD45−CD31+Kit+CD201+衍生物群体能够长期（16周）并且多个种系重组成年人辐射致死，尽管在OP9-DL1体细胞经过七天的培养都产生造血集簇（图2c-e）。HSCs的自我更新能力经过二次移植进一步被确定（图2d）。在CD41−CD43−CD45−CD201+群体中，仅在CD44+的亚群中产生HSC潜能（图2c-e）。以上数据证实E10.0尾半时期的胚胎CD41−CD43−CD45−CD31+ CD201+Kit+CD44+为含HSC的HECs。与其他的表面标记物比较，Flk1特异地定位在血管腔层，且很少、只有定位在最底层的IAHC细胞能够表达Flk1。在这里FACS分析依据它们内皮层定位的指示证实几乎所有的PK44包能够表达Flk1（图2f）。此外甲基纤维素培养基中造血克隆形成的能力在PK44群体中缺乏，进一步证实它们是ECs而不是定向造血祖细胞（图2g）。为了确定这些含HSC的HECs的转录组学，研究者将PK44细胞从E10.0 AGM通过流式分离，并且进行了scRNA-seq实验。测序的PK44经计算赋值与HEC共定位（图2h），并且与HEC特征的基因一样高表达（图2i）。一些关键的造血转录因子包括Runx1、Spi1、Gfi1以及Myb在造血潜能富集的PK44细胞中广泛显著表达（图2i）。因此免疫表型纯化的PK44细胞完美的表现了通过转录组确定的HECs。研究者接下来继续探究了这些含HSC的HECs细胞的表皮-造血双重潜能，需要捕获经历命运抉择的短暂的中间状态。研究者发现在胚胎E9.5–E10.0时期Kit+CD201+ ECs相较于Kit−或者Kit+CD201−内皮细胞群体具有相对更高的内皮成管的能力。此外在Kit+CD201+ ECs中CD44+和CD44−部分具有相当的内皮成管能力，但是在培养基中的造血细胞的产生无一例外的在内皮-造血双重潜能的CD44+组中被检测到，这一结果提示在HECs中很大一部分仍维持这内皮潜能。通过单细胞的体外诱导发现，PK44细胞中40.6%是造血后代，23%的只是内皮小管，显著的是2.7%同时具有内皮和造血的潜能。所有的这三组并不存在差异分布。双重潜能的低频率代表着HECs中间物的细胞状态沿着它们特异的通路。在体外培养的条件下内皮和造血补偿通过细胞的不对称分裂体现，再次强调了通过无监督计算机筛选捕获变化的功能群体的高效性。转录组确定的HECs和随后免疫表型确定的含HSC的HECs (PK44)表现出很大的分子特征。研究者将结合指定的转录组、免疫表型以及功能HEC进行下一步研究。Tif-HEC表达一系列HSC前体特征的基因，包括Hlf、Gfi1、Neurl3、Bcl11a、Adgrg1、Ikzf2、Angpt1、Mycn、Procr,提示它们与HSC相关的命运。研究者将从E11.0 AGM中分离得到的47 T1 pre-HSCs (CD31+CD45−CD41lowKit+CD201high)进行scRNA-seq。与tif-HEC相比，T1 pre-HSC表达相似水平的Runx1和Gfi1，和较高水平的Spn，确定了它们造血细胞的命运（图3b）。通过t-SNE可视化实验发现大多数T1 pre-HSCs与tif-HEC邻近（图3c）。重要的是，通过PCA分析PC2捕获了tif-HEC和T1 pre-HSC的转录差异（图3d）。在PC2阳性方向富集的基因在tif-HECs大多数坐落的区域，与细胞分裂、血管发育和细胞扩散相关（图3e）。与此一致的是，在HEC集簇中大约90%的细胞是增殖的（图1f），但是组成仅仅是T1 pre-HSCs的一半。但是作为血管细胞外间质组件，在tif-HEC中Col4a1的表达要高于在T1 pre-HSC，这也进一步确定了HECs的血管内皮特性（图3f）。相较而言，在PC2阴性方向富集的基因大多与RNA剪接和凝血相关（图3e）。结合在T1 pre-HSC中复现的Spi1，数据显示在T1 pre-HSC中的造血活性被活化。图3 含HSC的HECs与T1 pr-HSCs之间的关系
通过轨迹分析推断对tif-HEC到T1 pre-HSC的发育通路进行推断（图3g）。一致的是在OP9-DL1基质细胞E10.0 AGM区域分离到的PK44群体的体外培养诱导HSC活性的过程中，研究者观察到了T1 pre-HSCs免疫表型的出现（图3h）。这一结果与HECs和pre-HSCs的测序峰是一致的。随着后续的报道逐步从E10升高到E11。研究者同时在单细胞水平检测了E11.0 AGM区域T1 pre-HSCs (CD31+CD45− CD41lowKit+CD201high的内皮和造血潜能。惊奇的发现尽管与E10.0 PK44细胞相比内皮细胞的潜能降低，T1 pre-HSCs仍然维持与PK44群体相当的内皮-造血双重潜能。这一发现提示极少数功能富集的T1 pre-HSC细胞没有完全实现内皮-造血的命运转换。通过新建立的Neurl3-EGFP报告系统富集含HSC的HECs为了探究从非HECs或者那些具有内皮免疫表型C45-造血细胞中区分含HSC的HECs的单个标志物，研究者计算机筛选了在HEC集簇中再现的重要基因，总计11个被指定为含HSC的HECs特征的基因被筛选出，包括三个转录因子(Mycn、Hlf、Gfi1)以及细胞表面的标志物（图4a）。它们中的大多数和在T1 pre-HSCs中一样高表达，其中六个基因Neurl3、Dnmt3b、Mycn、Hlf、Gfi1、Gck属于pre-HSC的特征基因（图4a）。图4功能和转录组学评估Neurl3作为含HSC的HECs的重要基因
为了进一步验证生物信息学的发现并且准确的定义这些含HSC的HECs的定位，研究者选取了Neurl3建立了荧光报告小鼠系。由于Neurl3的平均表达水平在这些HEC特征的基因中是最高的，更易确保它的敏感性（图4a）。通过CRISPR/Cas9介导的基因敲入策略。EGFP被插入到小鼠Neurl3基因的翻译起始密码子确保EGFP能够同Neurl3一样准确表达（图4b）。研究者通过流式细胞术实验进一步评估了Neurl3-EGFP的表达。在E10.0 AGM区域，大约一半Neurl3-EGFP+细胞是造血细胞(CD41/CD43/CD45-positive)，组成了造血系统的1/4（图4c）。所有的Neurl3-EGFP+细胞是CD31+的并且几乎所有的都表达CD44，Neurl3-EGFP+ ECs主要主动脉定位指示（图4c）。重要的是，大多数的PK44细胞是Neurl3-EGFP+这也提示通过Neurl3-EGFP+ ECs富集HSC的能力。为了进一步验证Neurl3-EGFP-labeled ECs的HSC能力，研究者进行了E10.0 Neurl3-EGFP小鼠胚胎共培养和植入实验。尽管体外培养的条件下可以产生造血的集簇，所有长期（16周）培养的亚群无一例外的在植入CD44+Neurl3-EGFP+ ECs的接受者中被检测到，但是在CD44+Neurl3-EGFP− ECs中没有（图4e）。研究者进一步探究了Neurl3- EGFP+ ECs的转录命运，在E10.0 AGM区域将ECs和CD41−CD43−CD45−CD31+CD44+Neurl3-EGFP+(NE+)进行分离，将48个进行了scRNA-seq实验，所有进行测序的NE+细胞都通过了质控并且都表达EGFR，且大多数表达Nerul3和Runx1。t-SNE可视化发现它们的分布靠近tif-HEC并且主要在tif-HEC与earlyAEC之间。因此，与早期AEC相比，NE+细胞循环增加，在早期AEC和tif-HEC中表现出中间物的增殖状态。与tif-HEC相似，NE+细胞表现出HEC特征基因和pre-HSC特征基因的相对较高的表达水平(图2i, 4h)。相关性分析发现NE+细胞与tif-HEC具有高度的相似性并且通过层次聚类发现它们聚类在一起，然而早期AEC和晚期AEC都更加相关（图4i）。因此，从功能和转录组的评估Neurl3-EGFP-标记的ECs基本上符合无监督计算筛选对含HSC的HEC的预测。Neurl3-EGFP基因标记的HECs的原位定位和体外功能在E9.5–E11.0胚胎的AGM区域，CD44的表达标记背主动脉整个上皮层除IAHC外的细胞，结果与整个粘着染色法一致。重要的是，Neurl3-EGFP的表达受限于IAHCs和部分动脉ECs，Neurl3-EGFP 与Runx1表现出高度共表达的谱系。因此嵌于内皮层的Neurl3-EGFP+细胞大部分富集在假定的HECs上。通过FACS分析发现CD44+ ECs中Neurl3-EGFP+的平均在E9.5尾半部、E10.0和E10.5的AGM区域分别是35.7%、50.2%和17.7%。考虑到FACS的高度敏感性导致的轻微高估，数据与形态学的发现协同（图5a）并且通过scRNA-seq确定最终的HEC构成。HEC一时的变化同样与动脉内皮层Runx1的表达一致。HEC亚群的峰图出现在E10.0，比IAHC细胞和在AGM区域第一个被检测的HSCs到达峰图的时间相比早0.5天。Neurl3-EGFP的表达在完全主动脉下间质完全消失，与Runx1在E10.0-E11.0的广泛分布相反。尽管分散的Runx1+CD44+环绕血管细胞易被检测到，在背动脉外Neurl3-EGFP-表达的细胞很少检测到，即使是在E11.0.鉴于缺乏合适的抗体直接确定PK44细胞的解剖学定位，研究者比较了PK44和Neurl3-EGFP+细胞中FACS点的分布确定含HSC的HECs（图5a）。在E10.0的AGM区域，大约80%的PK44细胞和60%的IAHC细胞是Neurl3-EGFP+，伴随CD31+Kithigh细胞成为CD41/CD43/CD45-阳性的造血细胞。PK44的表达很大程度上不同于CD31+Kithigh细胞，这提示它们重要定位在上皮层而不是IAHC（图5b）。图5 Neurl3-EGFP报告系统进行HECs的原位定位和体外功能试验
由于少于一半的Neurl3-EGFP+ ECs，在E10.0的AGM区域表现出PK44的免疫表型。研究者在NE+细胞中通过索引分类继续挖掘了体外PK44和非PK44部分功能的关系。从E9.5到E10.5，只有内皮潜能、只有造血潜能和内皮-造血双重潜能具有不同的检测频率。在ECs中具有造血潜能的NE+细胞的平均频率峰在E10.0，并且在E10.5显著降低（图5e）。偏向内皮的潜能显著的在E10.5，可能由于Neurl3-EGFP-标记的HECs的减少和Neurl3-EGFP标记的一些晚期AECs。这三种潜能的细胞在PK44中显著高于非PK44细胞，具有内皮-造血双重潜能的无一例外的在PK44细胞中检测到（图5d）。因此，现有的PK44免疫表型表现出在Neurl3-EGFP+ HECs内富集的功能亚群（图5d），这三种潜能的细胞通过索引分类依据CD44或者Neurl3-EGFP的表达并未表现出明显的差异分布（图5f）。有趣的死，具有造血潜能的细胞而不是内皮潜能的细胞倾向于有更小的侧向散射密度（图5f）。为了解释含HSC的HEC的命运选择特异性，研究者添加了免疫表型的EC样本，从动脉结构形成开始的E8.0到E9.0，实现连续发育阶段的无缝取样。所有转录组确定的ECs再次富集成了六个集簇，其中四个与之前报道的一致，vEC、earlyAEC、lateAEC、HEC，新添加的样本主要在vEC、原始EC (pEC)、原始动脉EC(pAEC)三个集簇。原始EC (pEC)以Etv2的表达为特征，并且参与所有的E8.0细胞；原始动脉EC(pAEC)依据动脉的标记物Gja5的表达，作为最早起动脉EC群体，这两者集簇是最新确定的。用数学方法进行弹道分析发现两个从pEC到HEC的轨迹分叉，说明命运选择的两个关键步骤（图6a）。pEC首次选择动脉而不是静脉的命运形成pAEC，然后成熟为早期的AEC和晚期的AEC，HEC选择从中间动脉群体早期AEC分离（图6a），这与HEC表现出动脉的特征而不是静脉特征是一致的（图1h）。为了进一步揭示HEC特异性的分子机制，研究者特异性的选择了四个集簇，从pEC到HEC通路中除vEC和晚期AEC，并且加入T1 pre-HSC作为随后分析的结束点（图6b）。Monocle 2很好的概述了测序样本点阶段，并且沿着假定的时间点依据逐步造血的特异性演绎细胞的进化（图6c）。图6 从原生血管ECs中得到的含HSC的HECs分子进化机制
研究者确定了2851个基因的表达水平在五个集簇中是显著变化的，依据假定的时间点继续划分为五个主要的表达图谱。一般而言，表达谱1基因的表达在pEC中是最高的，依据动脉的特异性显著降低，然而依据造血的特异性轻微升高。这些基因主要与rRNA过程和有丝分裂相关。表达谱2和3中的基因在pAEC和早期AEC中表达最高，随后降低（图6d），这些基因分别主要与肌动蛋白丝组织和细胞迁移相关，提示在动脉ECs中不同成熟状态有不同行为。表达谱4和5在T1 pre-HSC的最后表达最高并且表现出造血相关的条目。在表达谱4中的基因在早期AEC阶段具有相对较高的水平，然而在表达谱5中的基因逐步升高。在这2851个表达谱中，75个转录因子是主要的调节因子与表达谱基因重叠。这些中心的转录因子被视为在HEC特异性过程中驱动或者协调变化分子机制（图6e）。大多数的转录因子属于表达谱4和表达谱5，这也提示在HEC特异性中来自原生血管中的ECs活性最大的转录因子是那些造血的群体（图6e）。研究者同时检测了之前体外HSPC再生中发现的28个转录因子的表达谱，其中19个功能转录因子是动态变化的，其中15个中心转录因子并且13个属于表达谱5。研究者进一步评估了每个细胞富集信号通路的动态变化。在五个集簇中富集信号通路的差异活化说明变化的表达谱与基因表达图谱类似（图6f）。在这些通路中在动脉特异性中与细胞周期、核糖体和剪接体是下调的，然而在造血特异中是上调的（图6f，g）。反之，一些通路经历完全相反的改变例如Rap1信号通路（图6f）。与动脉发展相关的信号通路活性或者关键的Notch信号通路在早期AEC时期出现峰值，随后在造血特异性逐渐降低（图6f，g）。一些炎症相关的信号通路，包括NFκB和TNF信号通路从早期AEC到晚期T1 pre-HSC被活化，与HSC生成过程中需要炎症信号通路是一致的（图6f）。对细胞进化和分子机制的研究有助于研究含HSC的HECs特异性及其HSC形成及相关再生的策略。在研究者的培养条件下EC生成起始后多步归纳，研究者通过新构建的Neurl3-EGFP报告小鼠模型准确的捕获了含HSCs的HECs，并且通过表面的标记物Procr+Kit+CD44+, PK44进一步做了相关富集分析，有待未来对HSPC继续进行高通量的研究。
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