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编译：怀瑾，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读皮肤响应牵张的能力已经被充分用于重建手术。在塑造组织结构的过程中，细胞会受到机械力的作用，由细胞骨架、细胞间粘附力以及细胞外基质（ECM）相互作用的微环境中产生。细胞通过整合激活不同信号通路来感知并响应这些刺激。机械转导的这一过程最终导致细胞形态、基因表达和细胞命运的改变。尽管表皮细胞对牵张反应的体外研究已经报道，尚不清楚在体内机械力如何影响个体行为。本研究建立了一种小鼠模型，可以在单细胞分辨率下研究皮肤表皮牵张的后果。利用克隆分析与定量建模和单细胞RNA测序相结合的多学科方法，表明牵张可刺激表皮干细胞产生瞬时更新活性来诱导皮肤扩张，而基础祖细胞的第二个亚群仍不断分化。转录和染色质分析确定了牵张如何调节细胞状态和基因调控网络。利用药理抑制剂和小鼠突变体，明确了体内单细胞分辨率下牵张介导的组织扩张机制。 原名：Mechanisms of stretch-mediated skin expansion at single-cell resolution 译名：单细胞分辨率下牵张介导的皮肤扩张机制 期刊：Nature IF：43.07 发表时间：2020.7 通讯作者：Benjamin D Simons, Cédric Blanpain 通讯作者单位：英国剑桥大学，比利时布鲁塞尔自由大学 DOI号：10.1038/s41586-020-2555-7 1.水凝胶诱导小鼠皮肤扩张 为研究体内牵张介导的皮肤扩张的细胞和分子机制，研究者建立了一种新的小鼠模型，模仿人类牵张过程并在皮肤下引入了自膨式水凝胶（可膨胀至预定的形状和大小）。在皮肤扩张的前两天，细胞面积增加而细胞密度降低，这与牵张一致。四天后这些参数恢复到稳态值，表明产生了新组织。在第2天，BrdU掺入量增加了两倍；4天后，BrdU掺入量逐渐减少，在扩增后的第14天达到对照水平（图1a-e）。为明确分化速率是否受影响，研究评估了扩增后角蛋白1+（Krt1 +）和Krt10 +基底上层细胞的产生。从第4天开始，我们观察到Krt1 + Krt10 +基底上层细胞的数量增加，这表明牵张介导的增殖与分化同步更新分裂。在形态发生和体外细胞培养过程中，牵张通常与细胞-细胞连接的重排有关。透射电子显微镜（TEM）显示，牵张诱导细胞间距增大和较厚的角蛋白束，桥粒和半桥粒保持不变。尽管进行了细胞重塑，经上皮失水（TEWL）评估显示皮肤屏障仍保持完整性。此外，粘附连接蛋白和紧密连接蛋白的表达没有变化（图1h，i）。然而，皮肤扩张后，α-连环素（a18）的张力敏感表位更易接近。粘附位点的黏着斑蛋白表达丰富，表明粘附连接在牵张后得以重塑。尽管在扩张后有炎症发生，但利用地塞米松阻止炎症并不会降低增殖，表明炎症对于介导细胞增殖并不是必需的。
图1.膨胀的水凝胶介导皮肤扩张 2.牵张促进干细胞再生 为了确定牵张介导的皮肤扩张过程中表皮细胞的命运动态，对Krt14-creER-RosaConfetti小鼠进行克隆分析。在两周的时间中，基底（和总）细胞克隆大小的稳定增加通过克隆持久性的降低得到补偿，从而总标记细胞随时间保持恒定。此外，克隆大小分布显示出指数状（图2a–f），这与通过群体不对称自我更新维持的单个等能细胞群体的动力学一致，正如在皮肤表皮其它区室发现的那样。在牵张介导的扩增过程中，基底细胞的平均克隆大小增加了3.4倍，总细胞含量增加了6.8倍，是对照条件下的两倍。但在这种情况下，基底细胞克隆大小的扩展不能通过克隆持久性的降低来补偿（图2g–k），表明组织扩展不仅增加增殖，而且改变了更新与分化之间的平衡 。为了解细胞命运在扩增过程中发生的变化，研究者首先考虑稳态控制条件。对克隆大小分布的详细数据分析显示，基底细胞克隆偏向于具有偶数个细胞，这一特征也存在于总克隆大小分布（图2b）。在 12-O-十四烷酰佛波醇13-乙酸酯（TPA）处理和扩展条件下，此功能均得到了大大增强，表明它并非源自统计噪声或分裂的同步性，但可能起源于利基样组织。为此研究者提出新的设计，背部皮肤小泡间表皮（IFE）由多个单元组成，每个单元包含两个基底细胞形成干-祖细胞样等级结构组织，一个属于更新细胞（干细胞）区室而另一个祖细胞通过终末分裂和分层来分化（图2l）。为确保在克隆中普遍存在偶数个细胞，假定祖细胞的末端分裂和分层主要由同一单元内干细胞的不对称分裂来补偿。此外，为解决克隆扩展超出两个基础细胞的问题，提出相关的细胞丢失和置换也必须在相邻单位之间发生。对克隆数据的拟合发现该模型可以预测基底克隆和总克隆大小的分布，平均为4.6天分裂一次。更新的细胞中大约五分之四的分裂导致细胞命运的不对称，与在其他皮肤隔室中发现的固有命运选择模型类似。值得注意的是，研究发现基于相邻区域相关分化和分裂的“单祖”模型无法很好的再现此数据特征（图2l）。与对照和TPA数据一样，扩增过程中克隆大小的分布也显现出指数依赖性（图2k）。因此，进一步研究是否一个微小调整的稳态模型可以预测克隆动力学。以BrdU掺入测得的增殖速率作为输入（图1e），发现命运不平衡的不断调整可以解释平均克隆大小的增加以及均匀大小克隆的富集，为在扩增过程中祖先异质性提供了证据。为了进一步验证两祖细胞模型和皮肤扩张后细胞命运的瞬时变化，研究者在分裂过程中使用BrdU单脉冲追踪分析法标记细胞，评估牵张过程中增殖细胞的命运，区分了倾向于更新的子代细胞（Krt14 + Krt10-）和致力于分化的子代细胞（Krt14 + Krt10 +）。发现与模型一致，牵张增加了BrdU + Krt14 + Krt10−细胞的比例，表明扩张促进了新生细胞群向细胞复制的失衡。
图2. 牵张介导的皮肤扩张过程中表皮干细胞的克隆分析 3.牵张相关的分子特征及单细胞RNA-seq分析 为了解扩增后基因表达的变化，研究者对不同条件下通过荧光激活细胞分选（FACS）得到的基础细胞进行微阵列分析。扩增和TPA条件下均上调的基因包括调节细胞周期，DNA复制，细胞存活和细胞骨架重塑相关基因。其中许多在伤口愈合过程中也被上调，表明它们代表了与细胞应激和增殖相关的常见转录模式。扩增条件下优先上调的基因集中体现为与细胞-细胞和细胞-ECM粘附，小GTPase，肌动球蛋白细胞骨架调节（图3a）和增殖相关的基因（包括Egfr，Ras，MAPK,AP1,Junb,Fos,YAP-TEAD通路组分等）（图3b）。为了揭示与扩增相关的染色质图谱变化，利用 ATAC-seq鉴定在扩增后第2天重塑的染色质区域。为明确与染色质重塑相关的转录因子，又对染色质重塑的区域进行基序分析。与染色质开放区相关的最常见基序对应于AP1，p63，STAT，ETS，CEBP，AP2A和GRHL2（图3c）。免疫染色证实AP1转录因子家族成员（如FOSL1，FOS和JUN以及p63，pSTAT3和KLF4）在基底和早期基底上层细胞中过表达（图3d-f）。这些结果表明牵张介导的皮肤扩张受到EGFR–Ras–MAPK通路的调节，从而激活一系列转录因子，如JUN和FOS19转录因子；介导表皮干细胞更新的p63等转录因子；与分化相关的转录因子CEBP21，KLF422和GRHL223，能够在皮肤扩张的同时维持皮肤屏障功能。为了评估所有基底细胞是否均能对牵张产生反应，在对照组、TPA处理和扩张条件下，对FACS分离得到的富含基底IFE，漏斗部，皮脂腺和基底上毛囊细胞的进行了scRNA-seq。基于克隆分析，首先验证scRNA-seq数据是否能够体现IFE增殖异质性。发现对照组的IEF细胞群具有干细胞样的未分化细胞群（属于共同表达基底和早期分化标记物（例如Krt1和Krt10）的增殖性基底定型细胞群）以及表达分化标记的非循环细胞（图3g）。在所有实验组中都发现了相同的IFE群，尽管在扩张和TPA处理组干细胞的增殖活性和定型细胞群相应增加（图3g）。此外，在扩张条件下存在表达与压力和过度增殖相关基因（如Krt6a，Sprr1a，S100a8，Klk10）的细胞（图3g）。值得注意的是，干细胞样的“伸展”簇在扩增后的第1天出现-因表达基础标志物（如Krt14，Itgb1）和高表达Ly6a，H2-K1，Thy1和Mt2而确定（图3g），也表现出调节增殖和立即早期基因（如E2f1和Egr1）以及AP1转录因子（如Fos，Junb和Jund），炎症因子（如Stat1,Stat3）和分化（如Klf4）的转录因子活性增加，正如SCENIC分析（图3j），表明只有一小部分基底细胞在转录水平上响应机械压力。为确定不同亚群之间的谱系轨迹，研究者在对照和扩张后第1天利用Slingshot对细胞进行拟时分析。在所有条件下都发现了一条分化轨迹，始于未分化的基底干细胞，经过祖细胞状态，并终止于分化程度最高的细胞（图3k,l）。在扩展第1天的条件下，发现了另一条分化途径，随应激状态连续变化，表示对机械刺激的不同响应（图3l）。这些数据表明干细胞对牵张具有快速而深远的响应。
图3. 转录和染色质重塑与牵张介导的皮肤扩张有关 4.黏附连接处的机械传导 TEM和分子分析表明牵张诱导细胞骨架重塑，以及编码肌动球蛋白细胞骨架重塑（如Diaph2和Diaph3）以及成蛋白（参与肌动蛋白调控）的基因转录水平增加（图3a）。为证实肌动蛋白重排介导牵张反应的必要性，研究者探究Diaph3缺失的影响，在扩张第1天，其顶部表面呈现F-肌动蛋白结构的细胞数量增加量降低，并且在Diaph3 cKO小鼠中未观察到牵张后细胞增殖的增加（图4a）。已有研究认为机械牵张促进肌球蛋白II的磷酸化，从而在体外细胞系和果蝇翅片中进行机械转导。与此一致，条件性敲除Myh9（肌球蛋白IIA的一个关键亚基）之后，增殖并未因牵张刺激而增加（图4b）。由于基底细胞通过重塑粘附连接处的牵引力而感知牵张，因此评估Diaph3和Myh9 cKO是否能阻止粘附重塑。受牵张刺激后，Diaph3和Myh9 cKO小鼠中α-连环蛋白张力敏感抗原决定簇和黏着斑蛋白并未增加。且Diaph3和Myh9的缺失使表皮失去对牵张的适应力，从而导致屏障缺陷（图4c）。5.皮肤扩张的分子调控 先前研究表明，体外机械拉伸通过激活MEK信号诱导增殖，并且ERK以肌球蛋白II依赖的方式被应力纤维激活。为了确定药理学抑制MEK-ERK途径是否会损害皮肤扩张后的细胞行为，研究者用MEK抑制剂（trametinib和pimasertib）处理小鼠，均导致细胞增殖减少和牵张诱导的分化细胞数量减少，证明了MEK-ERK-AP1信号在体内调节牵张反应的重要性。 既往研究表明YES相关蛋白1（YAP1）（Hippo信号的下游协同效应分子）和巨核母细胞白血病/心肌素样蛋白1（MAL，也称为MRTFA或MKL1，血清反应因子（SRF）的辅助因子 ）能够被机械刺激诱导。在皮肤中，YAP–TAZ和SRF途径对于表皮发育和伤口修复至关重要，但对于体内稳态无关紧要。体外研究表明MAL–SRF对在微模式表面培养的角质细胞的存活和分化中起着作用，而YAP是体外牵张培养的细胞增殖的驱动因素。为探究YAP和MAL在体内是否被激活以及何时被激活，研究者测定两者在扩张过程中不同时间的亚细胞定位。尽管YAP和MAL优先出现于对照组的细胞质中，但它们在扩增过程中逐渐转移到基底细胞核中。数据还表明YAP和MAL在牵张刺激后立即被激活，但类似于AP1家族成员，仅部分基底细胞中被激活。为了定义YAP的功能作用，研究者在表皮中特异性诱导Yap1和Taz缺失（Yap1-Taz cKO），评估它们在牵张过程中的作用。Yap1-Taz cKO表皮中第2天已经观察到BrdU掺入量的显著减少以及表皮厚度的减少（图4d）。此外，水凝胶膨胀后Yap1和Taz的缺失导致屏障缺陷（图4e）。为了评估MAL的作用，研究者在手术后立即用药理MAL–SRF抑制剂（CCG20397）处理小鼠，发现在第4天BrdU掺入量和表皮厚度显着降低（图4f）。而且对两种途径的抑制都完全阻断了对牵张的反应。 
图4.牵张介导皮肤扩张的分子调控 为了确定抑制牵张诱导细胞增殖的信号通路后，对体内细胞异质性和干细胞动力学的影响，研究者利用 BrdU脉冲追踪结合免疫组织化学方法对基底细胞进行短期谱系追踪。结果显示YAP–TAZ cKO小鼠以及MAL–SRF或MEK–ERK–AP1受抑制后，细胞更新分裂（BrdU + Krt14 + Krt10−）减少。在抑制条件下的短期遗传谱系追踪显示，皮肤扩张后克隆大小的增加也被抑制。此外，扩增后第2天scRNA-seq显示，尽管两种途径的抑制均导致相似的细胞增殖减少，但不同状态细胞的比例不同。抑制MEK-ERK-AP1途径后，细胞异质性相对不变，而MAL-SRF抑制剂则减少了具有应激特性的干细胞的丰度，并降低了基底细胞异质性（图4j，k）。这些数据表明，虽然MEK–ERK–AP1途径仅控制由牵张介导的增殖，但MAL–SRF途径控制了基底层和感知牵张的细胞异质性。本研究创新性地表明了表皮干细胞响应机械牵张的细胞和分子时空机制。克隆数据的定量建模表明，皮肤表皮中基底细胞的增殖和分化在空间和时间上是相互联系。研究者发现肌动球蛋白细胞骨架的调节因子（包括成蛋白和非肌肉肌球蛋白）对于在体感知皮肤牵张必不可少，在YAP1和MAL等典型机械传感器的上游起重要作用。值得一提的是，相同的信号传导途径能够在胚胎胰腺发育过程中以及在机械压迫后苍蝇背部中被激活，表明这些信号传导途径和转录调节因子在整个动物界以及胚胎发育与成年组织再生之间的机械转导中具有保守性。
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