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编译：小鹿同学，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读
肠道和大脑之间的连接监控着肠道组织及其微生物和饮食成分，从而调节生理性肠道功能，比如营养吸收和肠动力。因此，有可能存在能够检测肠道微生物并将其传递到中枢神经系统区域的回路，而这些回路反过来又调节肠道生理。本文中，研究者通过将限菌的小鼠模型与转录组学、回路示踪法和功能性操作相结合，从而表征了微生物群对肠道相关神经元的影响。研究者发现肠道微生物组调节肠道外表的交感神经元：微生物群的耗竭导致神经元转录因子——cFos的表达增加，且短链脂肪酸生产细菌对无菌小鼠的定植抑制了肠道交感神经节中cFos的表达。化学遗传学的操作、翻译图谱和顺行性跟踪确定一组远端肠-投射的迷走神经元，其在微生物群介导的肠道交感神经元调节中具有传入作用。肠壁的逆行多突触神经元示踪可确定在微生物耗竭过程中激活的脑干感觉神经核，以及传出的交感前运动区谷氨酸能神经元，其调节胃肠道的运输。这些结果揭示了微生物群通过一个肠-脑的回路控制肠道外表性交感神经的激活。
原名：Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut–brain circuit 译名：微生物群通过肠脑回路调节交感神经元 期刊：Nature IF：42.778 发表时间：2020年7月8日 通讯作者：Paul A. Muller & Daniel Mucida 通讯作者单位：美国洛克菲勒大学黏膜免疫学实验室 DOI号：10.1038/s41586-020-2474-7 为了更好地表征肠道外表神经元（eEANs）的联系及其活性或基因表达是否受肠道菌群的影响，研究者首先通过荧光逆行示踪剂确定了投射到肠道的感觉eEANs和效应eEANs之间的划分；接着，研究者通过转录谱分析、示踪法及亲和纯化等方法鉴定微生物介导的eEAN基因表达的变化，从而发现微生物群的缺乏会导致Fos基因（神经元活动的间接标志物）转录水平的显著提高；随后，研究者基于小鼠模型，使用多种微生物的操作策略发现特定微生物可以抑制肠道交感神经元中cFos的表达，而肠道外表的交感神经元活动也可以反映出肠道微生物群的变化；同时，基于短链脂肪酸（SCFAs）生产细菌的定植可抑制神经元活动这一现象，研究者通过质谱定量分析确定了SCFAs和其它肠道-相关的代谢物或体液因子是肠道交感神经元激活的生理调节剂；最后，研究者基于小鼠模型调查了可能与微生物耗竭后促进交感神经活动相关的神经元回路，通过化学遗传学操作、示踪法、原位杂交等手段最终确定了迷走神经的调控可激活一组脑干感觉核，它们可以探测肠道菌群及其代谢产物的变化。肠道外表相关的神经元（eEANs）（包含感觉器官的传入和自主神经的传出）可同时感测肠道的多个区域，从而将信息传输到其它组织，并补充内在EANs（iEAN）控制肠道的功能。研究者试图更好地表征eEANs的联系以及其活性或基因表达是否受肠道菌群的影响。为了确定eEAN细胞体的位置，研究者将荧光逆行示踪剂（霍乱毒素β亚基（CTB））注入到不同肠段的壁内，并解剖了伸向肠道的外在神经节，特别是感觉器官的神经节、背根神经节（DRG）和交感神经腹腔-肠系膜上神经节（CG-SMG）（图1a~c）。肠道区域的单独CTB跟踪突出了左结节相对于右结节的偏倚，交感神经元的神经分布从近肠端向远肠端的密度增加。不同肠道区域的同时CTB追踪表明，这些解剖学上不同的肠道区域的感觉和交感神经由非重叠的周围神经元细胞群体介导（图1d）。这些结果强调了投射到肠道的感觉eEANs和效应eEANs之间的划分。
图1.肠道相关的交感神经元在没有微生物群的情况下被激活。a.左图描绘了从肠道区域到C57BL/6J SPF小鼠的CG-SMG以及左（L）和右（R）结状神经节（NG）的逆行CTB555或CTB488示踪流程。右图代表十二指肠（n=5）、回肠（n=6）和结肠（n = 5）的追踪图像。b,c.十二指肠（n=3）、回肠（n=4）和近端结肠（n=4）中逆行标记的每个L-NG和R-NG（b）或CG-SMG（c）内CTB+神经元的数量。d.CTB488（十二指肠）、CTB555（回肠）和CTB647（结肠）标记的C57BL/6J SPF小鼠中CG-SMG和NG的三次CTB示踪。e,f.火山图表示了Snap25RiboTag无菌（GF）小鼠和SPF小鼠的NG（e）或CG-SMG（f）中差异表达的基因。g,h.在Snap25RiboTag GF小鼠与SPF小鼠的NG（g）和CG-SMG（h）中富集的基因本体论途径。i.使用了抗-cFos抗体的C57BL/6J GF小鼠和SPF小鼠中CG-SMG的免疫荧光图像。白色箭头表示cFos+核。j.与采用GF饮食（n=7）或正常食物（n=5）的SPF小鼠以及采用正常食物的Taconic品系的SPF小鼠（n=5）相比，来自Rockefeller（n=9）或Mount Sinai（n= 10）的C57BL/6J GF小鼠中CG-SMG的cFos+神经元数量。图a,d,i.中比例尺为50μm。图b,c,j.数据表示为平均值±s.d。图b,c.进行了两尾未配对的t检验。图e~h中分析的独立生物样品的数量（n）在括号中表示。红色/蓝色点表示以2为对数转换的倍数变化大于0.5；斜体括号表示以2为对数转换后的倍数变化大于1；Padj表示由双向Wald检验P值小于0.05得出的两尾Benjamini-Hochberg检验P值。虚线表示显著性阈值（1.3），其由单尾的Fisher’s检验和消除算法计算得出。图j使用了Tukey的多重比较，从而进行了单向方差分析（ANOVA）。研究者利用转录谱分析神经节并通过CTB跟踪使用核糖体翻译亲和纯化（TRAP）鉴定了微生物介导的eEAN基因表达的变化。研究者将泛神经元Snap25Cre小鼠与Rpl22lsl-HA（RiboTag）小鼠杂交，并对从无特定病原体（SPF）小鼠和无菌Snap25RiboTag小鼠中分离出的结状神经节、胸段DRG和CG-SMG进行了TRAP测序。相对于无菌小鼠来说，研究者在SPF小鼠的DRG中没有观察到有效翻译基因表达的实质性变化。研究者对结状神经节的基因本体论分析表明，无菌小鼠中与突触信号传导和神经元活化相关的基因出现了富集（图1e,g）。此外，无菌小鼠的CG-SMG就可塑性和信号传导来说表现出丰富的基因本体论途径，并且Fos基因（一个神经元的立早基因，同时也是神经元活动的间接标志物）的转录水平明显更高（Padj =1.08×10-9）（图1f,h）。免疫荧光分析证实了，从无菌小鼠中分离出的CG-SMG比其SPF对应物表现出更多的cFos+神经元核（P=1.7×10-5）（图1i,j）。这些数据表明，微生物群的缺乏会导致肠道外表交感神经元活动水平的升高。为了解决特定的微生物是否可以介导CG-SMG神经元的补剂抑制，研究者使用了多种微生物的操纵策略。将粪便从SPF供体转移至无菌小鼠中可使其CG-SMG神经元中cFos恢复到与SPF条件下相当的水平，这表明微生物群可以抑制肠道外表的交感神经元（图2a）。仅活细菌的存在还不足以抑制肠道-投射的交感神经活化，因为分节丝状菌（SFB）（Akkermansia muciniphilia或Bacteroides fragilis）在无菌小鼠内的单一定植并未导致CG-SMG中cFos水平的降低，而具有明确细菌群落定植的无菌小鼠却能够达到SPF中的水平（图2b,c）。反之，使用广谱抗生素消灭SPF小鼠中的微生物群会导致CG-SMG中cFos+神经元的增加（图2d,e）。单一抗生素的处理也足以驱动交感神经系中cFos的表达，总之，这表明细菌的特定亚群能够抑制cFos的激活（图2f）。此外，一次链霉素的口服灌胃会在灌胃后12 h和24 h导致CG-SMG神经元的活化，但在处理后5天就恢复到了基础水平（图2g）。
图2.稳态失调会触发肠道交感神经的激活。a. C57BL/6J GF小鼠（n=6）和分析前2周用SPF小鼠粪便定植过的GF小鼠（GF-FC，n=8）中CG-SMG的cFos+神经元数量。b.分别被SFB（n=5）、A. muciniphilia（n=3）、B. gilgilis（n=5）或OligoMM12集团（n=4）或ASF（n=3）单一定植的C57BL/6J小鼠中CG-SMG的cFos+神经元数量。c. C57BL/6J GF小鼠（n=3）和来自Weill Cornell的Clostridium spp.菌群定植的GF小鼠（n=4）中CG-SMG的cFos+神经元数量。d.与用蔗糖素（n=6）或水（n=5）处理的对照小鼠相比，在饮用水中施用万古霉素、氨苄青霉素、甲硝唑和新霉素（VAMN）（n=12）处理2周的C57BL/6J SPF小鼠中CG-SMG的cFos+神经元数量。e.通过抗-cFos抗体、VAMN或蔗糖素处理过的C57BL/6J SPF小鼠中CG-SMG的免疫荧光检验。f.使用单一抗生素（甲硝唑，n=10；新霉素，n=10；氨苄青霉素，n=10；万古霉素，n=15）或蔗糖素（n=5）处理两周后C57BL/6J SPF小鼠中CG-SMG的cFos+神经元数量。g.链霉素（n=11）或磷酸盐缓液（PBS; n=6）处理24小时后的C57BL/6J SPF小鼠、链霉素（n=6）或PBS（n=4）处理24小时后的BALBc/J SPF小鼠、链霉素（n=5）或PBS（n=5）处理24小时后的CBA/J SPF小鼠以及链霉素处理5天后的C57BL/6J SPF小鼠（n=4）中CG-SMG的cFos+神经元数量。h.左图是使用VAMN或水处理FosGFP SPF小鼠2周后，将CTB555注入小鼠回肠中获得CG-SMG免疫荧光图像（右图）的方案。i~1.经蔗糖素（n=5）或VAMN（n=5）（图i）、VAMN+生理盐水（n=10）或胍乙啶（图j）、链霉素（n=12）或PBS（n=13）（图k）或链霉素+生理盐水（n=10）或胍乙啶（n=10）（图l）处理的C57BL/6J SPF小鼠的胃肠道通过时间。图e,h中比例尺为50μm。图a~d,f,g,i~l中数值表示为平均值±s.d。图a,c,i~l中进行了两尾未配对的t检验。图b,d,f,g进行了具有Tukey多重比较的单向方差分析。图b虚线表示GF小鼠中cFos+神经元的平均数（334）。图i~l虚线表示允许每只小鼠进行运动度测量的最长时间。为了解决激活的交感神经元是否投射到肠道的问题，研究者将荧光CTB注射到了经广谱抗生素处理过的FosGFP小鼠（其表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的cFos）回肠中。研究者在CG-SMG中观察到CTB+（红色）和cFos+（绿色）神经元之间存在广泛共定位（图2h），这增强了一个可能性，即在微生物耗竭后激活的交感神经元投射到肠道内，但并没有排除投射到与CG-SMG连接的其它内脏组织的可能性。最后，研究者发现在微生物耗竭的小鼠中阻断儿茶酚胺的释放可以挽救其胃肠道蠕动的变化，这表明交感神经活动的增强是造成这些小鼠肠动力下降的部分原因（图2i~1）。这些结果表明，特定的微生物可以抑制肠道交感神经元中cFos的表达，而肠道-特定的交感神经活动可以反映肠道微生物群落的变化。研究者观察到，当引入已知可恢复短链脂肪酸（SCFAs）水平的微生物群体时，限菌的操作可抑制CG-SMG神经元。小鼠盲肠中SCFAs的质谱定量证实了特定的抗生素已消除，且无菌定植得以维持，丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐的水平达到了不同程度。盲肠的大小与交感神经的激活无关，这表明机械感知在微生物耗竭的情况下可能没有主要作用，尽管急性扩张会引发交感神经的激活。肠道感染引起的cFos和SCFA的水平之间缺乏相关性，与之相反的是，在高于腔内SCFA水平的每个限菌操作中，CG-SMG内cFos+神经元的数量均与之相关。因此，研究者测试了在微生物群耗竭的小鼠中补充SCFAs是否能恢复其CG-SMG中的cFos水平。饮用水中添加外源的丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐可抑制链霉素诱导的cFos。先前的研究表明SCFAs可以穿过血脑屏障；但是，脑室内注入SCFAs并不能抑制链霉素诱导CG-SMG中的cFos。此外，三丁酸甘油三酯（一种丁酸盐前体药物）的施用足以抑制链霉素处理过的无菌小鼠和SPF小鼠CG-SMG神经元中cFos的表达，且对盲肠的重量没有影响。因此，SCFAs抑制交感神经cFos的能力最有可能是由外周的进程来介导。SCFAs可以通过激活G蛋白偶联受体（包括GPR41，GPR43或GPR109A）、抑制组蛋白去乙酰酶或充当能量底物来调节靶细胞。Gpr41–/–小鼠显示在CG-SMG中cFos+神经元的数量略有增加（P=2.5×10−2），这暗示着肠道上皮细胞（iEAN和eEAN）表达的GPR41在调节肠道交感神经节中具有潜在作用，但研究者并未分析其他SCFA受体-缺失的品系。除了SCFA的水平出现改变外，微生物群耗竭小鼠的肠道内结合型胆汁酸的水平升高，而未结合型胆汁酸的水平降低。尽管胆汁酸螯合剂（已知会结合胆汁酸，从而阻止其重吸收，同时在肠道末端增强胆汁酸受体的拮抗作用）诱导了未处理过的SPF小鼠中CG-SMG的cFos水平，但因胆管烧灼引起的所有肠内胆汁酸的流失会导致链霉素诱导的cFos的丧失，表明其它的微生物群-调节的代谢物在交感神经的调节中也发挥作用。此外，其它微生物调节的上皮细胞因子的研究表明，胰高血糖素样肽1（GLP-1）和酪酪肽（PYY）可以调节交感神经活性和胃肠蠕动。总体而言，以上结果确定了SCFAs和其它肠道-相关的代谢物或体液因子是肠道交感神经元激活的生理调节剂。研究者调查了CG-SMG的上游可能与微生物耗竭后促进交感神经活动相关的神经元集群或回路。本研究的多种分析并不支持CG-SMG的交感神经元能够直接感测微生物的耗竭，或在调节肠道交感神经活动中对内脏性神经元起作用。禁食经抗生素处理的小鼠或无菌小鼠会导致CG-SMG的激活显著降低，这进一步指明了一个依赖于中枢神经系统（CNS）的回路（对于万古霉素、氨苄青霉素、甲硝唑和新霉素（VAMN）等处理，链霉素处理小鼠和无菌小鼠中分别P=1.9×10−5、P=9.8×10−4和P=1.6×10-2）。如此一来，研究者将表达单体红色荧光蛋白（mRFP）的伪狂犬病病毒PRV-614注入到SPF小鼠的回肠或结肠中，从而研究脑干中相关的交感神经前动区域。通过AdipoClear组织清除术对PRV-RFP注射后第4天的大脑进行ClearMap分析，发现了多个与肠道突触连接的脑干核（图3a~c）。通过对艾伦大脑图集原位杂交数据库的搜索，研究者发现抑制性氨基丁酸能神经元和兴奋性麸氨酸神经元可能是参与肠道交感神经元调节的集群。研究者将PRV-RFP注射到Slc32a1L10-GFP小鼠（其中VGAT-GFP标记了抑制性神经元）和Slc17a6L10-GFP小鼠（其中VGLUT2-GFP标记了兴奋性神经元）的回肠中，发现RFP+/GFP+神经元存在广泛共定位，且大部分延髓巨细胞（Gi）神经元被鉴定为VGAT+，外侧巨细胞旁核/腹外侧延脑区（LPGi/RVLM）神经元被鉴定为VGLUT2+，而其它神经递质的贡献则很小（图3d~g）。研究者对不同肠段进行的双重PRV示踪表明，每个脑干区域中的大多数神经元都与肠的多个段相连（图3h）。这些实验定义了一组常见的传出前运动区皮层的脑干神经元，它们与肠道的不同区域进行多突触连接，并可能控制肠道的交感神经活动。
图3. 交感神经前运动区控制CG-SMG神经元和肠道运动。a.将PRV注射入肠道进行多突触追踪（对于c~k）的方案。b.方案显示了组织清除后进行的ClearMap分析。c.将PRV-RFP注射到C57BL/6J SPF小鼠的回肠中，在注射后第3天和第4天进行ClearMap分析，结果显示出了中缝/延髓巨细胞核。比例尺为1mm。d,e.将PRV-RFP注射到小鼠回肠4天后，VGATL10GFP小鼠（d）以及VGLUT2L10GFP（e）小鼠的脑干免疫荧光图像。pyr:锥体束；RPa：中缝苍白核。f,g. VGATL10GFP小鼠以及VGLUT2L10GFP小鼠的RPa、Gi和LPGi/RVLM中PRV+VGATL10GFP+（f）或PRV+VGLUT2L10GFP+（g）神经元的定量。h.注射PRV-GFP（十二指肠）和PRV-RFP（回肠）四天后，C57BL/6J SPF小鼠脑干的免疫荧光图像。I,m.将AAV5-DIO-hSyn1-hM3Dq-mCherry注入VGATCre小鼠的Gi/RPa（i）或VGLUT2Cre SPF小鼠的LPGi/RVLM（m）中的方案。j~l, n~p. 用1mg/kg C21的剂量处理VGAT:hM3DqGi/RPa小鼠（n=6）或对照小鼠（n=6）以及VGLUT2:hM3DqLPGi/RVLM小鼠（n=14）或对照小鼠（n=10）后，其胃肠道通过时间（j,n）、结肠动力（k,o）以及CG-SMG中的cFos+神经元数量（l,p）。图d,e,h中比例尺为50μm，且突出显示了相关的脑干区域，箭头指示GFP+RFP+细胞，星号指示RFP+GFP-细胞。图f,g,j~l,n~p中数据表示为均值±s.d。图j~l,n~p进行了两尾未配对的t检验。图f,g进行了Tukey多重比较的单向方差分析。图j,k,o中虚线表示允许每只小鼠进行运动度测量的最长时间。肠道交感神经的分布参与了血流量的控制、肠道蠕动和上皮细胞的分泌。与前文确定的前运动区脑干核在调节肠道交感神经活动中可能发挥的作用相一致，研究者在无菌小鼠（已知该小鼠表现出肠动力异常）内观察到了中缝苍白核（RPa）和LPGi/RVLM神经元中cFos的升高。为了鉴定并永久性标记抗生素处理后立即激活的神经元，研究者结合FosTRAP2:tdTomato小鼠的可塑性图谱，将荧光PRV注射到小鼠的近端结肠，从而标记了肠投射的神经元。与cFos的增加一致，研究者观察到这些小鼠LPGi/RVLM中与肠道连接的（PRV+）TRAP+细胞的百分比增加了。为了直接确定这些脑干集群是否调节了肠道交感神经活动，研究者分别向VGATCre或VGLUT2Cre小鼠的Gi或LPGi/RVLM内双向注射了兴奋性的“被设计药物专门激活的设计受体”（DREADD）AAV5-DIO-hSyn-hM3Dq-mCherry。对野生型小鼠或（Gi）VGAT小鼠施用DREADD配体化合物21（C21）并不会影响基线肠动力的测量，但会大大减慢（LPGi/RVLM）VGLUT2小鼠内的肠道运输和粪便颗粒排出，并相应地增加（LPGi/RVLM）VGLUT2小鼠CG-SMG中的cFos（图3i~p）。这些发现表明，谷氨酸能LPGi/RVLM的脑干神经元可以驱动肠道交感神经的活动，从而减慢胃肠道的运输。研究者在注射PRV后四天对ClearMap数据的检查揭示了先前报道的与胃和直肠连接的其它脑干区域，特别是背迷走神经复合体（包括迷走背侧运动神经核（DMV）、孤束核（NTS）和极后区）。先前的研究表明NTS和极后区可以直接整合来自迷走感觉神经元或循环因子的肠道感测信息，并且这些核心与LPGi/RVLM相连接。确实，在链霉素处理后，研究者观察到NTS和极后区中cFos表达的总体增加（图4a）。这些区域在链霉素处理过的无菌小鼠和FosTRAP2:tdTomato小鼠中也显示出高水平的cFos，进一步表明了它们的功能相关性。此外，对链霉素处理过的小鼠施用三丁酸甘油酯可抑制极后区的cFos水平，而NTS中的cFos水平仍然升高，这表明极后区对于肠道SCFAs来说，是一个潜在的远端感觉中枢，尽管在稳态失调或微生物耗竭期间，NTS可能会感测到其它SCFAs和未知的内脏信号。这些结果表征了一组脑干感觉核，它们经过调整以探测肠道微生物群或其代谢物的变化。
图4.微生物耗尽时激活标记会改变并连接到肠道投射迷走神经传入的脑干感觉核内。a.用PBS（n=9）或链霉素（n=9）进行管饲后24 h，C57BL/6J SPF小鼠中极后区（AP）、NTS以及NTS-胶质核（SolG）的cFos+神经元数量。b~d. 注射C21（10 mg/kg）后6小时，SNShM4Di小鼠（n=6）或对照SPF小鼠（n=4）（b）、链霉素（n=5个神经节）或PBS（n=5个神经节）处理后24小时，用树脂毒素处理的C57BL/6J SPF小鼠（c）以及注射10 mg/kg C21后4小时，Phox2bbhM4Di小鼠（n=5）或对照小鼠（n=6）（d）中CG-SMG的cFos+神经元数量。e,f.火山图显示了来自SNSRiboTag小鼠与AvilRiboTag小鼠（e）或Nav1.8RiboTag（f）小鼠中NG差异表达的基因。g.C57BL/6J SPF小鼠中R-NG的RNAscope原位杂交图像，显示了Scn5a（Nav1.5）的表达（红色）以及将CTB488（绿色）注入到近端结肠后的免疫荧光。白色箭头指示了CTB+Scn5a+细胞。h.左图是将PRV-GFP注入脑干后从C57BL/6J SPF小鼠获得的NG免疫荧光图像（右）（1），或者是PRV-GFP注入近端结肠之后获得的sdVx免疫荧光图像（2）（右）。在第二种情况下，小鼠的结肠近端接受了CTB594注射。虚线轮廓突出显示了NG。I,j.将AAV9-Syn-ChrimsonR-tdTomato注入小鼠的R-NG后，其近端结肠（i）或远端回肠（j）的免疫荧光清除组织图像（顶部图像放大了1倍，比例尺为500μm；底部图像放大了4倍，比例尺为250μm（j））。图g,h.中比例尺为50μm。图a~d的数据表示为平均值±s.d。图a~d进行了两尾未配对的t检验。图e,f分析的独立生物样品的数量（n）表示在顶部括号中。Padj =由双向Wald检验P值小于0.05得出的两尾Benjamini-Hochberg检验P值。微生物耗竭的情况下NTS/极后区中cFos的表达增加表明传入感觉神经元在调节肠道交感神经活动中具有功能性作用。肠上皮、黏膜和肌层中外表神经元的感测主要由结状神经节和DRG内的感觉传入来进行，这两者也通过上述的逆行策略进行鉴定。为了靶向结状神经节或DRG的感测活性，研究者首先将SNSCre小鼠与抑制性hM4Di（Rosa26lsl-hM4Di）小鼠进行了杂交。研究者认为，如果传入的eEANs参与了该回路，那么向SNShM4Di小鼠施用C21以调节感觉性eEAN的活性可能会在功能上出现微生物信号丢失的拟表型。确实，SNShM4Di小鼠在施用C21后表现出CG-SMG神经元的显著激活（P=3.5×10-3）（图4b）。为了确定是单独抑制结状神经节，还是共同抑制结状神经节和DRG造成了这种表型，研究者首先使用了肠道-投射TRPV1+传入神经元的化学和遗传切割。我们发现这种处理并不能阻止CG-SMG中抗生素诱导的cFos表达，也不能在未处理的SPF小鼠中诱导cFos，这表明感觉性DRG神经元在微生物耗竭期间激活的回路中并没有主要作用（图4c）。接下来，研究者将Rosa26lsl-hM4Di小鼠与Phox2bCre小鼠杂交，靶向结状神经节、DMV和一小群iEANs，同时避免DRG神经元的重组。向Phox2bhM4Di小鼠注射C21也导致CG-SMG中cFos+细胞数量的显著增加（图4d）。由于SNShM4Di小鼠和Phox2bhM4Di小鼠也都靶向CG-SMG神经元，因此研究者直接对CG-SMG神经元进行了选择性的化学遗传学操作，从而排除了hM4Di-介导的激活作用。值得注意的是，与未激活CG-SMG神经元的其它泛感觉器官的Cre小鼠品系（AvilhM4Di和Nav1.8hM4Di）中的结状神经节相比，SNS小鼠结状神经节的TRAP-测序分析显示，SNSCre-靶向小鼠的结状神经节中Scn5a（Nav1.5）基因出现了富集（图4e,f）。通过原位杂交与远端肠逆行示踪的耦合，研究者证实了远端肠投射的结状神经节的一部分神经元确实是Nav1.5+（图4g）。这些化学遗传学、示踪法、TRAP和切割实验表明，调节特定的迷走神经传入足以驱动肠道交感神经活动。为了确定迷走神经的调控是否可以激活前文鉴定的感觉脑干核，研究者用C21处理了SNShM4Di小鼠和Phox2bhM4Di小鼠，这导致小鼠中NTS和极后区cFos水平的显著增加。研究者无法通过手术来评估这些区域中迷走神经感觉输入的需求，因为膈下迷走神经切断术（sdVx）本身就会导致NTS/极后区中cFos的增加。然而，LPGi/RVLM的荧光PRV双向注射实验证实了这两者均与结状神经节相连。此外，研究者向sdVx小鼠的结肠壁中注射荧光PRV后，发现标记了的左和右结状神经节偏向了右侧，这反映出了从远端肠CTB追踪中观察到的趋势（图4h）。最后，迷走神经传入投射的可视化揭示了远端肠中神经元进程的密集标记，表明从结状神经节的感觉传入神经元将纤维投射到微生物量较密集或SCFA浓度较高的部位（图4i,j）。总的来说，本研究结果鉴定了一个肠-脑-肠回路，通过该回路不同的微生物和微生物代谢产物可调节肠交感神经元和脑干感觉核（具有整合肠特异性刺激的能力）的激活。本文介绍的功能性、回路和基因表达的相关研究表明，EAN（可直接或间接地通过上皮细胞检测微生物或其代谢物）是一种核心感觉系统，其中微生物组成的改变足以大幅激活肠投射的神经元。CG-SMG的其它靶标（如脾脏、胰腺和肝脏）也可能受微生物群的调节，从而对系统性免疫和代谢产生影响。此外，交感神经信号可影响肠道和其它地方中各种靶细胞内的基因转录，包括肠道常驻巨噬细胞和先天性淋巴样细胞。研究者鉴定了许多潜在的微生物群衍生信号，它们可以调节肠道交感神经的活动以及与肠道相连接的神经元集群。进一步表征自主神经系统的微生物调节以及整合微生物信号的其它回路，可能是理解调控与肠-脑轴相关的肠动力、内脏绞痛、肠道免疫以及全身性疾病的关键，同时这对治疗策略的确定也是必不可少。为了更好地表征肠道与大脑之间的连接以及肠道外表神经元的活性或基因表达是否受肠道菌群的影响，研究者基于小鼠模型，利用转录组分析、回路示踪法以及化学遗传学等操作发现了肠道微生物组可通过一个肠-脑回路来调节肠道外表的交感神经元。本研究的结果有助于深入理解与肠-脑轴相关的胃肠蠕动、肠道免疫与系统性疾病，并为这些疾病的治疗提供了新的策略。
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