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编译：怀瑾，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读
自身免疫性疾病可由免疫相关的单基因错变引起。本研究起源于一位早发型、多器官免疫功能异常患者，由JAK1中镶嵌的功能获得性突变（S703I）导致，该突变编码的激酶对下游细胞因子的信号转导至关重要。利用单细胞RNA测序在单细胞水平检测基因镶嵌现象，发现在不同细胞中JAK1转录本主要受限于单个等位基因，因而引入突变“转录型”（transcriptotype）的概念。功能上，该突变增加JAK1活性并激活与之相关的JAKs。S703I JAK1诱导的细胞因子信号级联反应不受经典的JAK1介导。基于此，对患者进行JAK抑制剂（托法替尼）治疗，其临床疾病迅速被缓解。此研究为个性化医疗提供新的思路，同时明确了其中的基本生物学原理。原名：Complex Autoinflammatory Syndrome Unveils Fundamental Principles of JAK1 Kinase Transcriptional and Biochemical Function 译名：复杂的自体炎症综合征揭示了JAK1激酶转录和生化功能的基本原理 期刊：Immunity IF：21.522 发表时间：2020.8 通讯作者：Dusan Bogunovic 通讯作者单位：纽约西奈山伊坎医学院 DOI号：10.1016/j.immuni.2020.07.006 研究基于一位罕见病例，一名18岁女性患有复杂的原发性自发炎和特应性综合症（图1 A）。该患者出生于无血缘关系的家庭，无免疫病史。出生时，发现该患者具有线状分布的广泛脓疱疹，主要影响身体的左侧（图1B）。约1岁时，出现反复呕吐和腹泻。重复进行内窥镜活检表明在各个部位（最常见的是结肠）出现了慢性、未明确的炎症反应，结肠的嗜酸性细胞浸润一直存在（图1C）。3岁时，她体重迅速增加，表现出浮肿和蛋白尿，肾活检证实为膜性肾病（MN）（图1D），经皮质类固醇激素治疗无效，随后对环孢素和他克莫司治疗也无效。结合家族史和病史（父母身体健康，患者早期发病），研究者推测隐性或从头遗传突变是病因（图1E）。因而对患者及其父母的外周血细胞进行全外显子测序。随后的变异分析排除了隐性遗传的可能。鉴于疾病的不对称表现，考虑较低读取频率的从头镶嵌突变的可能性。明确了一种候选的从头变异，JAK1 c.2108G> T，占映射到该区域的读数的27％（图1E和1F）。通过Sanger测序证实了c.2108G> T变体的存在（图1G），而健康个体的基因组序列均不存在该变体。此突变导致高度保守区域703（S703I）位置处的丝氨酸被异亮氨酸取代，预测具有高度破坏性。进一步调查非造血组织中c.2108G> T的存在，利用突变特异性探针进行数字液滴PCR（ddPCR），以估计在不同组织中携带突变的细胞的比例。从咽拭子、粒细胞、外周血单核细胞（PBMC）和内镜活检样品中分离出上皮细胞和相关免疫细胞鉴定DNA中各种频率的突变（图1H）。这些组织代表了所有的三个胚层，表明该突变发生在受精和原胚形成之间的第1~12次细胞分裂中（图1I）。
2. 等位基因表征显示S703I在JAK1上赋予了功能获得性（GoF）S703I突变位于JAK1的假激酶结构域（图2 A）。尽管S703I位于已鉴定的种系JAK1突变之间，但这些其他突变对其下游的影响（LoF和GoF）却不相同。为评估该突变潜在的致病性及其对JAK1功能的影响，将WT JAK1，S703I JAK1和空载体慢病毒转导入U4C细胞（先前被选为缺乏内源性JAK1的纤维肉瘤细胞系）。在没有细胞因子刺激的情况下，用S703I JAK1或荧光素酶进行的转导可诱导STAT蛋白的基础磷酸化和活性靶基因的转录（图2B-2E）。S703I转导的细胞对IFN-α刺激具有高反应性，包括STAT1和STAT2的近端磷酸化以及IFN刺激相关基因（ISGs）的高转录（图2B和2C）。类似地，这些细胞响应IFN-γ或IL-6刺激后可过度磷酸化下游STATs（图2D，2E）。为了直接确认患者细胞突变的致病性，从患者的PBMCs衍生出了EBV永生化B细胞（B-EBV）品系。患者WT与突变B-EBV细胞中STAT磷酸化的比较表明，无论在基线水平还是细胞因子刺激，S703I 在JAK1 上均具有GoF作用（图2F和2G）。
图2.S703I JAK1诱发高度反应性STAT信号3. S703I JAK1可独立于其激酶活性，而激活伴侣JAKs，为了探究STAT信号上调的潜在机制，研究者评估S703I对JAK自磷酸化的影响。与STAT磷酸化的增加相一致，S703I JAK1本身被过度磷酸化（图3 A）。此外，JAK2，TYK2和JAK3磷酸化也被上调（图3B–3D），这表明相互作用的伴侣JAKs也可能在GoF中起作用。进一步推测JAK1 S703I可能通过受体复合物形成的增加或JAK蛋白之间的直接相互作用而过度激活伴侣JAKs活性。研究评估JAK1 S703I是否允许其细胞表面存在更多的细胞因子受体，但I型IFN受体亚基（IFNAR2）的表面染色表明，WT JAK1和S703I JAK1细胞中的受体表达相同，这表明受体复合物的JAK1结构不受基因突变的影响（图3E）。接下来，研究者假设突变的JAK1假激酶结构域使JAK2和TYK2的激酶活性反式激活。为此突变了JAK1的ATP结合位点（K908A），使其催化失活。结果证明，在JAK1失活的情况下，STAT磷酸化程度大大降低（图3F和3G）。但与正常的JAK1失活（K908A）相比，S703I JAK1的激酶结构域失活（S703I / K908A）后，在细胞因子刺激下，其STAT磷酸化异常增加（图3F和3G）。表明S703I JAK1反式激活了JAK2和TYK2，提示除了经典的顺式调控外，假激酶结构域还可以反式调控伴侣JAKs。该机制与报道的其它JAK1 GoF突变（A634D）一致（图3H）。最后，为了在临床上证明JAK1 S703I（及其他JAK介导的疾病）中JAK活性的重要性，研究比较选择性和非选择性JAK抑制剂（非洛替尼和托法替尼）的效价。与泛-JAK抑制剂不同，由于被JAK1假激酶反式激活的伴侣JAKs持续传导信号，JAK1特异性抑制剂无法完全消除JAK1 S703I信号（图3I）。这些发现强调了反式调节的生化功能和临床重要性，并表明选择性JAK不一定意味着良好的临床疗效。
图3.S703I JAK1通过伴侣JAKs的激活介导过度活跃的STAT磷酸化为更深入研究S703I对免疫细胞的影响，研究者对患者的全血进行了大规模质谱流式细胞表型分析（CyTOF）。尽管JAK1在免疫细胞的分化和增殖中起着核心作用，但患者的免疫细胞分布大部分仍在正常范围内（图4A和4B）。临床检测显示嗜酸性粒细胞波动高。B细胞的频率比健康者低，但在很大程度上仍保持幼稚、记忆和类别转换细胞的正态分布。天然杀伤（NK）细胞中CD56hi细胞增加（比健康对照组高12倍以上）（图4B），这类细胞被认为较不成熟的细胞亚型，但与具有高细胞毒性的CD56lo亚型相比，其增殖和细胞因子产生速度较快。患者NK细胞与STAT1 GoF NK细胞（也被认为是未成熟的细胞）同时进行表型分析，结果提示与来自STAT1 GoF患者的细胞不同，JAK1 GoF NK细胞在表型上与经典的未成熟“ CD56bright” NK细胞类似。但该表型是否是由原发性病理或临床干预导致的仍待确定。进一步，进行磷酸化CyTOF分析全血所有主要免疫细胞中JAK1下游所有STAT的磷酸化。观察到STAT1，STAT3，STAT4，STAT5和STAT6的磷酸化升高，但不具有普遍性。某些免疫亚群表现出特定STAT的高基础磷酸化（图4C）。为了评估观察到的基础磷酸化的功能后果，研究者检测大量PBMCs的下游基因的表达，发现下游pSTAT靶基因（包括IFI27，IFIT1，MX1和SIGLEC1）的表达升高。免疫组织化学验证非造血组织的基线STAT磷酸化水平，在皮肤和胃肠道活检中检测到了高度磷酸化的STAT1和STAT3。在没有明显增加循环JAK-STAT细胞因子浓度的情况下观察到这种基础磷酸化作用，表明内在的S703I JAK1活性推动了这一过程，这与上述的体外结果一致（如图2B-2F所示）。5.体外细胞因子刺激患者细胞可产生非典型的信号通路用一系列促使JAK1与各种细胞因子受体、JAK伴侣和下游STAT靶标结合的细胞因子对全血进行离体刺激。经IFN-α或IL-2刺激，患者白细胞中STAT1和STAT3或STAT5被过度磷酸化；而IL-4对 STAT6磷酸化的影响与健康对照组细胞相似（图4D）。同样IL-5刺激也表现出正常STAT5磷酸化。类似地，在患者的B-EBV细胞中也存在这些差异反应。但IL-2或IL-4刺激只能在患者细胞中诱导STAT1磷酸化，与细胞因子诱导的典型信号级联反应相反（图4D）。这种非典型的信号反应提示S703I将扰乱JAK1，使其跨越经典的信号轴从而建立非典型的途径。这些结果表明，S703I JAK1是GoF体外突变，在STAT信号激活中显示出杂乱性和特异性。
图4. CyTOF分析显示细胞因子、STAT和细胞特异的功能获得6.scRNA-Seq映射了S703I JAK1细胞分布和转录特征为了追踪免疫细胞类型之间的差异，研究者对患者的PBMCs进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），旨在以单细胞分辨率基因表达模式与细胞类型以及已知的JAK1基因型相关联的方式，特异性映射和评估S703I JAK1对免疫细胞亚群的影响。但基于液滴的scRNA-seq数据通常限于5'或3'转录区域，不包括JAK1 mRNA中S703I位点。因此，研究者利用定制的条形码微珠和改良的文库制备程序，将inDrops scRNA-seq方法调整为靶向JAK1的第16外显子（包含S703I位点）。利用改进后的方法分析患者PBMCs，基于基因表达模式的细胞聚类和手动注释可区分预期的PBMC群，其相对频率与CyTOF分析一致（图5 A）。同时观察到CD56hi NK细胞频率增加。基于JAK1靶向序列数据库，研究者将假定的每个细胞JAK1基因型（基于转录本序列）对应到PBMC子集。发现此子集中突变等位基因在免疫细胞簇之间分布很不均匀（图5B和5C）。如B细胞和单核细胞大多携带WT转录本，而69％的CD56hi NK细胞包含S703I突变的JAK1 mRNA。这种分布的异质性表明细胞对突变的内在耐受性的差异，这也与CD56hi NK细胞亚群的扩增以及NK细胞中JAK1的表达高于其他细胞类型一致。接下来，研究者进行差异基因表达分析，比较了WT和携带JAK1突变等位基因的患者细胞，发现在WT与突变单核细胞中 IFI44L的ISG表达和一个ISG集具有显著差异（图5D和5E）。这些数据表明，不同细胞对S703I的耐受性有所不同，并证实GoF的细胞内在特性。考虑到杂合突变的镶嵌性，研究者期望观察到一些仅包含WT JAK1转录本的细胞（即纯合WT JAK1）和其他同时包含WT和S703I JAK1转录本的细胞（即杂合S703I JAK1）。事实证明这2个等位基因的表达几乎是互斥的（图5F，左图）。相比之下，数据集中其它基因杂合变体表现出预期的双等位基因分布（图5F，右），表明JAK1可能存在单等位基因偏倚。为进一步验证上述假设，收集健康供体的杂合PBMCs单细胞（即包含一个JAK1同义多态性位点rs2230587），用等位基因特异性探针进行qPCR，结果显示与对照组基因不同（图5H），这两个等位基因的相对表达不是正态分布（图5G）。经典的杂合性遗传理论已不能充分解释此现象，也促使人们对疾病的遗传渗透性有更深入的了解。
图5. scRNA-Seq映射JAK1等位基因分布、转录影响和表达模式7. 托法替尼治疗可以挽救临床和生物学上的免疫功能障碍确定JAK1高度活跃性是该疾病的可能驱动因素后，JAK抑制剂用于临床治疗。比较了两种泛-JAK抑制剂降低（S703I转导的）U4C细胞中基础STAT磷酸化的能力。尽管其对JAK1的相对效力较低，但托法替尼抑制STAT磷酸化的效力与鲁索替尼相当（图6 A），再次反映了JAK1催化和STAT过度磷酸化的独立性。在患者来源的B-EBV细胞具有相似的结果（图6B）。接下来，模拟生理剂量用两种化合物离体处理了患者血液，并进一步评估IFN-α刺激的抑制作用。利用磷酸化CyTOF对全血免疫亚群的磷酸化STAT抑制作用分析显示，托法替尼在几乎所有细胞中都具有更强的抑制性（图6C）。广泛的功能研究后，研究用低剂量的托法替尼（每天5 mg）治疗该患者。8周内循环炎症标记（红细胞沉降率[ESR]和C反应蛋白）恢复正常（图6D和6E）；皮炎完全改善（图6F）；到6个月时，患者报告胃肠道症状已完全缓解。结肠组织的活检显示隐窝结构的恢复和嗜酸性浸润的完全消退（图6G）。治疗后患者稳定保持2年，但不幸的是，患者因COVID-19死于急性呼吸衰竭。最后，研究者证实托法替尼治疗可挽救患者细胞中JAK亢进现象。从PBMCs分离的RNA显示，治疗后 ISGs表达逐渐降至正常水平（图6H）。进一步CyTOF分析也印证了基础STAT磷酸化水平的降低。在所有细胞类型中STAT3，STAT4，STAT5和STAT6磷酸化均降低，而STAT1磷酸化在某些细胞类型中降低（图6I）。总体而言，这些结果验证了S703I JAK1是广泛性免疫失调的病因，提示精准医学既可作为罕见疾病患者的治疗方法，又可作为发现基本生理机能机制的手段。
图6. 托法替尼抑制STAT过度磷酸化，并缓解病情本研究从未诊断的疾病病例入手，通过对基因多态性及生理学机制的探索，提高了对个性化医学中基因组和转录组水平镶嵌现象的理解。从基因组上讲，该JAK1突变未被发现，但可在整个组织中定位追踪其胚胎起源。单细胞测序技术的发展为此类研究提供高效的研究手段。偏倚等位基因表达和镶嵌现象，可能成为未来从遗传学角度探究未诊断疾病和感染携带者的重点。
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