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编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读磷花器官发育的ABCDE模型在鉴定花器官方面有重要作用。A和E基因鉴别萼片，A+B+E基因鉴定花瓣，B+C+E基因鉴定雄蕊，D和E基因鉴定心皮，ABCDE基因均属于MADS-box转录因子的MIKCC组，而在兰花中一些MIKCC基因在进化过程中缺失。其中，B基因在花瓣和唇片中高表达，而A基因在萼片中高表达，然而，A基因在蝴蝶兰和石斛兰两种兰花中没有明显的器官特异性表达模式。许多兰花通过嗅觉、视觉和触觉吸引不同传粉媒介，花的颜色和形态发挥重要作用。花的发育与次生代谢和碳水化合物贮藏有关，是一个复杂的生理过程。石斛花蕾发育过程中，果聚糖和淀粉含量下降，可溶性糖浓度在花完全开放时达到峰值，导致水势下降。甲基-D-赤藓醇磷酸盐（MEP）是异戊二烯前体生物合成的中间体，其衍生物在合成类胡萝卜素和挥发性化合物中发挥重要作用，研究表明MEP在花瓣中积累。此外，碳水化合物是花发育所必需的物质，不仅提供能量，而且是花的次生代谢产物（如颜色和香味分子）的前体。石斛属是兰科植物第二大属，许多石斛植物因其药用价值而闻名，如火山斛、金斛和铁皮斛。铁皮石斛是一种珍贵中草药，广泛分布于热带和亚热带地区。本研究利用转录组和代谢组分析铁皮石斛的早期花蕾和盛开花，探讨其花发育的分子机制，有助于更好地了解铁皮石斛花发育过程中的基因调控和代谢过程。原名：Transcriptome sequencing and metabolite profiling analyses provide comprehensive insight into molecular mechanisms of flower development in Dendrobium officinale (Orchidaceae) 译名：转录组和代谢组揭示铁皮石斛的花发育分子机制 期刊：Plant Molecular Biology IF：3.302 发表时间：2020.09 通讯作者：段俊 通讯作者单位：中科院华南植物园 DOI号：10.1007/s11103-020-01058-z ① 植物材料。铁皮石斛种植于温室，采集5mm花蕾（S1）、10mm花蕾（S2）、盛开的花（S3），-80℃液氮冻存。② 转录组测序。提取各发育阶段的花样品总RNA，Illumina HiSeq对cDNA文库进行高通量测序。TopHat进行序列拼接，HTSeq计算基因表达水平，倍数变化为2.0/0.5视为差异表达基因（DEG），使用COG、GO、KEGG、Pfam、eggNOG、Nr、KOG进行注释，根据表达模式进行STEM聚类分析。③ 代谢组分析。紫外分光光度计测定叶绿素a/b含量、总花青素含量，UPLC-MS/MS分析类胡萝卜素含量（包括八氢番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素醛、玉米黄质、叶黄素），HPLC分析甘露糖含量。每个发育阶段的样品冻干研磨，加入80%甲醇和0.1%甲酸提取，进行总代谢物HPLC-MS/MS。铁皮石斛花与其他兰花有相似结构，包括雄蕊和雌蕊融合而成的柱状结构，三片花瓣状萼片，两片花瓣和一个唇瓣（图1a）。这些花器官在发育早期都在花蕾中（S1），柱短，唇瓣顶端有紫色斑点，其余部分为绿色。在花芽发育中期（S2），柱伸长明显，唇呈紫色。当花成熟开放时（S3），萼片和花瓣呈黄色，大部分区域出现红色素沉着。S1和S2的差异表达基因最少，1176个基因下调，1466个基因上调。S1对比S3差异表达基因最多，有3283个基因下调，3473个基因上调（图1b）。所有差异表达基因分为8个基因簇，基因簇1和4分别在S3时期上/下调，而在S1和S2无显著变化。基因簇2和3分别在S1-S3时期逐渐上/下调（图1c）。基因簇1包含最多基因（2413个），这些基因富集于脂质运输和代谢、运输和分解代谢、次生代谢物生物合成。这表明花发育过程有活跃的脂质代谢和次生代谢。代谢组结果表明大多数代谢物与新陈代谢相关，只有少数代谢物与环境信号传递和遗传信息传递相关（图2a）。在三组两两比较中（S1 vs S2、S1 vs S3、S2 vs S3），分别有126、160和129个代谢物存在显著差异，其中数量最多的是类黄酮，其次是氨基酸及其衍生物。S1 vs S2有26个独特化合物，S1 vs S3中有27个，S2 vs S3中有24个（图2b）。所有差异代谢物分为5个簇，代谢簇1和5在S1中含量较高，而在S2中含量降低。代谢簇2在S3中大量积累，代谢簇3和4在S2中浓度最高（图2c）。代谢簇5中的大多数氨基酸及其衍生物在花的发育过程中逐渐下降。KEGG分析表明S1 vs S2的重要途径是异喹啉生物碱生物合成、二苯乙烯/二庚烷和姜辣素的生物合成，而S1 vs S3和S2 vs S3的重要途径是苯丙素的生物合成。
图1 铁皮石斛花发育过程的转录组测序分析。a：花的三个发育阶段：S1（花蕾表面淡绿色，约5mm）-S2（中等花蕾淡绿色表面，约10mm）-S3（成熟黄花）；b：三个发育阶段差异表达基因数目；c：差异表达基因的聚类，以及GO富集。
图2 铁皮石斛花不同发育阶段的代谢组分析。a：代谢物的KEGG注释；b：三个发育阶段两两比较的差异代谢物数目；c：差异代谢物聚类分析。特定转录因子对花器官发育具有明显的作用，如ABCDE模型的基因，均属于MADS家族转录因子。本研究铁皮石斛基因组共发现35个MADS转录因子基因：分为MIKC*（4个基因）和MIKCC（31个基因）（图3a）。有18个MADS基因在三个发育阶段表现不同的表达模式，其中所有的SQUA基因、2个AP3/PI基因、2个AG基因、3个SEP基因均为差异表达基因。3个SQUA基因在S1-S3中表达下调，而AP3/PI、AG和SEP基因除DoAGL1外均表达上调（图3b）。
图3 铁皮石斛MADS转录因子的系统发育及表达分析。a：MADS转录因子分类；b：MADS基因在花发育过程中的表达水平。除了MADS转录因子以外，其他许多转录因子也影响花的发育，如生长素应答因子（ARF）。铁皮石斛基因组中共鉴定22个ARF基因，这些ARF基因可分为三组（图4a）。共12个DoARF基因为差异表达基因，其中10个基因在S1阶段高表达。基因组中发现2个ARF1同源物和4个ARF2同源物（图4b），且这些同源物均在S1-S3中表达下调，DoARF16除外。在花发育过程中，ARF6/ARF8分支基因均未出现差异表达，ARF7/ARF19分支基因DoARF4在S1-S3表达上调，ARF分支的DoARF20在S1中表达最高，在S2中表达最低，而DoARF15、-18和-21在S2中有高表达。
图4 铁皮石斛ARF基因的系统发育与表达分析。a：ARF基因分类；b：花发育过程ARF基因的表达水平。铁皮石斛花发育过程中，颜色从绿色到黄色明显变化。叶绿素a/b含量逐渐下降（图5a-b）。4个叶绿素生物合成基因CHLH、CHLM、CHLE和DVR在S1和S2中高表达，但在S3中表达大幅下降（图5c）。叶绿素分解代谢基因NYC1和PAO呈上调表达模式，在S3中表达最高。因此，叶绿素a/b合成减少和降解增强可能是花发育过程颜色变化的原因。在类胡萝卜素生物合成途径中，PSY基因在S3高表达，两个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶（ZDS）和番茄红素异构酶（CRTISO）的基因表达模式与PSY相似（图6a）。β-胡萝卜素是由β-胡萝卜素异构酶（CIS）催化由9-cis-β-胡萝卜素异构化形成，两个CIS基因在S3中表达最高。类胡萝卜素包括茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、玉米黄质、新叶黄素在S3中大量积累，然而叶黄素含量在花发育过程中没有显著变化（图6b）。类黄酮合成基因在花蕾期（S1和S2）表达量最大，但在S3中表达量显著下降（图7a）。类黄酮合成途径基因CHS、F3H、CYP75B1、FLS、ANS、DFR的表达模式相似。根据黄酮类化合物的积累规律将其分为3个簇（图7b）。簇1的类黄酮在S1中富集，簇2在S3中富集，簇3在S2中富集。簇1中有7种类黄酮：芹菜甙元4-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖甙、栀子素、C-戊糖基木犀草素、七甲氧基黄酮、甲基芹菜素C-戊糖苷。簇2中有两种黄酮醇（槲皮苷 3-D-半乳糖苷、槲皮苷-3-O-槐糖苷）和异黄酮（鹰嘴豆素 A 7-O-葡萄糖苷、黄豆苷元、黄豆黄苷）。槲皮素及槲皮素衍生物在S2中大量积累，而槲皮素3-D-半乳糖苷和槲皮素3-O-葡萄糖苷在S3中大量积累。4种类黄酮代谢前体（查尔酮、酪氨酸、苯丙氨酸、香豆酸）从S1-S3含量逐渐下降。花青素是一种类黄酮，是决定花颜色的主要色素。铁皮石斛花的唇瓣和蕊柱中有紫色斑点，表明花中含有花青素。然而本研究中HPLC-MS没有检测到花青素。采用分光光度法表明开放的花中，唇部的总花青素含量>300 μg/g FW，柱部>100 μg/g FW（图8a）。分析类黄酮合成途径基因CHI、CHS、F3H、CYP75B1、FLS、ANS、DFR在不同花组织中的表达，结果表明大部分黄酮合成途径基因在S2中高表达，DoCHI基因在唇瓣高表达。ANS和DFR在柱上表达高于萼片和花瓣（图8b）。这表明花青素在花蕾唇处大量合成。
图5 铁皮石斛花发育过程中叶绿素含量及其代谢途径基因分析。
图6 铁皮石斛花发育过程中类胡萝卜素代谢途径基因及含量变化。
图8 不同花组织中总花色苷含量和类黄酮生物合成途径基因的表达模式。甘露聚糖是铁皮石斛主要的生物活性多糖。本研究分析了从铁皮石斛花中分离得到的花芽多糖的单糖组成。甘露糖是主要的单糖，S2中的甘露糖含量比S1高8倍（图9a）。分析甘露聚糖生物合成基因的转录水平，包括核苷酸生物合成基因、核苷酸糖转运基因、纤维素合成（CSLA）基因。在核苷酸糖生物合成通路基因中，UGD、FRK、PMM在S1和S2中高表达，而GMP和2个GAE基因在S3中高表达（图9c）。一个编码UDP-半乳糖/UDP-葡萄糖转运体（UTR）基因在S3中高表达。编码GDP-甘露糖转运蛋白的三个基因在三个发育阶段表达差异较大，其中两个基因在S1中表达最高，一个基因在S3中表达最高。铁皮石斛中含11个CSLA基因，DoCSLA2、-4、-9和-11在S2中表达量最高，DoCSLA5和-7在S1和S2中表达最高，其他基因表达量较低，如DoCSLA1和-10（图9d）。
图9 甘露聚糖含量及甘露多糖生物合成基因在花发育过程的表达模式。a：花发育三个阶段甘露糖含量的HPLC-UV色谱分析；b：S1-S3中甘露糖相对含量；c：甘露聚糖相关编码基因的表达模式；d：CSLA基因的表达模式。先前研究表明内源IAA和ABA影响花蕾发育。TAA1基因编码一种色氨酸转移酶，在IAA生物合成的第一步介导色氨酸向吲哚-3-丙酮酸（IPA）转化。RNA-seq结果显示TAA1在S1中的表达量最高，分别比S2和S3高2.6倍和5.6倍（图10a）。这说明IAA可能在S1中大量积累。确实，IAA在S1中含量最高，在S2和S3中含量逐渐降低（图10b）。9-cis-类胡萝卜素双加氧酶（NCED）编码基因在S2和S3中上调（图10c）。相一致地，ABA含量在花发育期间逐渐上升（图10d）。因此，IAA和ABA都在铁皮石斛花的发育中发挥作用。
图10 吲哚乙酸（IAA）和脱落酸（ABA）在铁皮石斛花发育三个阶段的生物合成。a：IAA生物合成途径基因的表达；b：花发育过程中IAA相对含量；c：ABA生物合成途径基因的表达；d：花发育期间ABA相对含量。植物叶片含大量参与光合作用的叶绿素。铁皮石斛中S1时期叶绿素含量较高，S3含量较低。叶绿素b在高等植物中常转化为叶绿素a而降解，NYC1、PAO等基因是催化叶绿素降解的关键调控因子。叶绿素生物合成通路4个基因CHLH、CHLM、CHLE和DVR的表达在S1和S2中较高，而在S3中显著下降，可能是导致叶绿素含量相对较高的原因。一致地，类胡萝卜素含量高时，S3中的PSY基因表现高表达。这表明胡萝卜素积累是造成铁皮石斛花呈黄色的原因。然而，无颜色的类黄酮大部分在S1中积累，而黄酮醇仅在S2或S3中大量积累，且唇瓣花青素大量积累，表明唇瓣的花青素生物合成在发育中发挥重要作用。激素分析显示从早期花芽到成熟花，生长素IAA含量降低，脱落酸ABA含量增加，说明这两种激素在调节花的发育中发挥协调作用。生长素缀合物是植物维持游离IAA水平的主要方式，与酰胺相连的IAA-氨基酸缀合物是植物生长素缀合物的主要形式，其中IAA-Asp和IAA-Glu广泛存在。本研究仅检测到IAA-Glu，且在花发育过程中呈下降趋势。先前研究表明ABA通过调控类黄酮途径基因参与类黄酮生物合成。本研究中类黄酮途径基因ANS、CYP75B1和CHS在S2中表达量最高，与S2中ABA含量较高可能相关。本研究利用转录组和代谢组分析，揭示了铁皮石斛花发育的分子机制。研究结果表明MADS和ARF转录因子参与花的发育过程，且类黄酮和多糖的生物合成影响花的发育过程，且内源生长素IAA和脱落酸ABA是花发育的重要调控因子。研究结论有助于阐明铁皮石斛花发育的重要调控机制。
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