氢气生物学机理（6）：氢气与辣根过氧化物酶（1）

上一篇我们介绍了氢气可能进入乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性中心通过弱相互作用影响酶的活性。AChE的活性位点的变化不好捕捉，从研究的操作层面并不是一个好的模型，我一直在思考解决的方案。选择辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）作为研究对象是在研究氢气与羟自由基（hydroxyl radical，·OH）反应的过程中逐渐清晰的。

一、氢气与自由基反应

氢气具有还原性，但在生物体内与·OH的直接反应是否是氢气发挥生物学功能的主要原因是有争议的，Dole等在Science发文认为与·OH的反应是氢气治疗肿瘤的基础（Dole, 1975)；日本太田成男教授在Nature Medcine发文提出氢气生物学作用的基础是选择性清除·OH和过氧亚硝酸根(peroxynitrite，ONOOH)等毒性自由基（Ohsawa，2007），这也是目前氢气生物学机理的主流观点。

然而，Nature Medcine同期评论（Wood，2007）在肯定氢气生物学功能的同时也提出疑问：细胞内能够与·OH发生反应的成份，如蛋白、膜脂、GSSH等，不仅含量远大于氢气，而且反应常数也远远大于·OH和氢气的反应常数 (1 x 10¹⁰ M^-1s^-1 vs.4.2 x 10⁷M^-1 s^-1 )，因而，氢气与·OH的反应常数太低并不足以支持其优先于细胞内大量存在的高反应常数的底物发生反应，特别是在氢浓度比较低的情况下。交流中我发现这也代表了大部分化学专家的观点，但多数生物学专家认为生物体内很复杂，发生的反应与常规的化学反应可能不同，尽管我们现在不知道有什么不同。

由于很多研究都证明氢气作用过程中有自由基的减少，与活性氧相关的SOD、CAT、GSSH、MDA等也发生变化，氢气抗氧化作用得到广泛认可。但氢气的抗氧化作用有两种可能性，一是直接与自由基反应清除已经产生的自由基，二是减少自由基的生成。由于争论并没有达成一致，我希望通过自己的研究去重复论文中唯一直接证实氢气清除·OH的体外实验（其它三个细胞实验都是间接证据）。

Ohsawa等证明氢气与·OH直接反应的体外体系是芬顿反应（Fenton reaction），然而在不同[Fe²⁺]/H₂O₂比值下芬顿反应·OH等自由基的产生量会受到氧气浓度的影响（Qian SY，1999）。 

Ohsawa在Nature Medcine发表论文的反应条件是在H₂O₂浓度为5μM时，在[Fe²⁺]/H₂O₂比值为 20︰1 的条件下测定HPF荧光量来表征氢气对·OH的清除量。在这种条件下，加入氢气后有可能造成的氧气浓度的微小变化都可能极大地影响·OH的产生量，但论文没有设置排除这种影响的对照。

我们采用不同[Fe²⁺]/H₂O₂比值，以氮气组为对照，HPF荧光法检测·OH的量，发现在H₂O₂浓度为 1mM ([Fe²⁺]/H₂O₂ ratio 1:10) 时HPF的荧光信号高于H₂O₂浓度为 5μM ([Fe²⁺]/H₂O₂ ratio 20:1)时，表明产生比较多的自由基。在H₂O₂浓度为1mM时氢气组的HPF荧光信号与对照组相比没有降低，表明氢气并没有与·OH反应；在H₂O₂浓度为5μM时，氢气组与氮气组的HPF荧光信号与对照组相比均降低，这可能是因为氢气和氮气的存在影响了溶液中氧气的浓度,从而在此条件下·OH产量减少造成的（Li Q，2021）。

另外，2013年Science在同一期发表两篇论文对HPF作为·OH的特异性荧光检测试剂提出挑战（Liu Y，2013；Keren I，2013）。乙醇和硫脲（thiourea）都可以作为羟自由基的清除剂，实验发现在芬顿反应中加入硫脲可降低HPF的荧光，但是乙醇却不能。认为HPF实际上是被芬顿反应最初形成的高价铁（FeO²⁺）氧化的，而不是被其分解生成的·OH氧化。 

研究还发现HPF可以被辣根过氧化物酶（HRP）迅速氧化，辣根过氧化物酶与H₂O₂反应在酶的活性中心产生与芬顿反应类似的高价铁中间体，但不会释放·OH。HPF甚至可以被铁氰化物氧化，铁氰化物是一种中等氧化电位（+0.44 V）的铁-铁螯合物。

辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）是以铁卟啉为辅基的血红素蛋白，同类蛋白包括细胞色素氧化酶（线粒体复合物IV）、过氧化物酶、细胞色素P450超家族、一氧化氮合酶等众多重要的生物酶（Poulos，2014），这就意味着以HPF检测·OH的体外和细胞实验都可能受到干扰。

Ohsawa等证明氢气清除·OH的三个细胞学实验都是选用 PC12细胞（Ohsawa，2007），用线粒体呼吸链抑制剂 antimycin A 诱导产生活性氧（ROS），通过HPF荧光和ESR发现氢气可以减少·OH。在这个实验中，自由基信号的减弱既可以是因为自由基的产生减少了，也可以是因为自由基产生之后被清除了，还有可能受到过氧化物酶类及胞内铁的影响，这些实验结果以及和自由基相关的SOD、CAT、GSSH、MDA等指标的变化并不能分辨自由基产生和清除的区别。因而也无法证明氢气是通过清除自由基发挥作用的。

基于以上几个主要原因，我认为Ohsawa等证明氢气与·OH直接反应的体外芬顿反应实验体系是有缺陷的，还需要进一步的实验证据证明（马雪梅等，2020）。

除了以上芬顿反应体系，我们在HRP和高价铁体系也测定了加入氢气对HPF荧光的影响。研究发现，氢气可以提高HRP组的荧光强度，氮气作为一种惰性气体对照则没有这种作用，三价铁（ FeCl₃ ）和铁氰化钾（ K₃Fe(CN)₆）体系也没有这种作用（Li Q，2021）。

这些研究也引起了我们对HRP的兴趣，我们对氢气和HRP的关系进行了进一步研究，下一篇将介绍氢气与HRP作用的细节。

题外的话：

这部分研究内容主要由研究生李秦剑、仪杨，教师谢飞等在2015年至2017年参与完成，内容不多但思考和寻找证据的过程有些曲折有挑战，所做的研究远多于公布的内容。相关内容首次公开是2017年在佛山举行的氢分子生物医学分会年会的大会报告。当时压力是有的，毕竟氢气清除自由基的理论有两篇顶刊的加持，还有近千篇论文已经基于“选择性抗氧化”假说发表，这是在新机制的证据不完善的情况下对氢生物学领域内主流观点的质疑。但我认为有破才有立，否则思想会被禁锢，我们团队的研究也因此没有囿于单纯的抗氧化，有更多的跳跃。另外，这一观点只是基于我们现有的研究提出的一家之言，也可能有没有考虑到的地方，比如细胞的特定区域（如细胞的膜系统）是否反应会不一样等都值得探讨。所以决定把相关内容的细节发到开放共享平台供大家讨论（Li Q，2021）。如果有杂志对这种争鸣性质的文章感兴趣可以联系正式发表。

现在蛮喜欢包括预印本、公众号自媒体在内的开放共享模式，可以自由发表学术观点还可以避免英文论文动辄几万元高昂的发表费，如果没有考核的压力和团队年轻人发展的压力我可能会全部选择这种模式。现阶段论文高昂的发表费用和对华丽外表（数据堆砌）的过度追求慢慢把科学变成了奢侈品。

DNA双螺旋结构的解析无疑是上个世纪最重要的生命科学进展，在给学生上课时我喜欢讲这段历史，其中Watson和Crick发表在Nature的DNA结构的文章是划时代的，一起重温这篇一页纸的经典论文。

参考文献

1. Dole M, Wilson F, Fife W. Hyperbaric hydrogen therapy: a possible treatment for cancer[J]. Science, 1975, 190(4210):152-154.

2. Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J]. Nature Medicine, 2007, 13(6):688-694.

3. Wood K C , Gladwin M T. The hydrogen highway to reperfusion therapy[J]. Nature Medicine, 2007, 13(6):673-674.

4. Qian S Y , Buettner G R . Iron and dioxygen chemistry is an important route to initiation of biological free radical oxidations: an electron paramagnetic resonance spin trapping study[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 26(11-12):1447-1456.

5. Keren I , Wu Y , Inocencio J , et al. Killing by Bactericidal Antibiotics Does Not Depend on Reactive Oxygen Species[J]. Science, 339.

6. Liu Y , Imlay J A . Cell death from antibiotics without the involvement of reactive oxygen species.[J]. Science, 2013, 339(6124):1210-1213.

7. 马雪梅,张鑫,谢飞,赵鹏翔,张昭,仪杨,张晓康,马胜男,李秦剑,吕宝北,刘梦昱,YAO Mawulikplimi Adzavon,孙学军,李英贤.氢气生物学作用的生物酶基础[J].生物技术进展,2020,10(1):15-22.

8. Li Q, Xie F, Yi Y, Zhao P, Zhang X, et al. Hydroxyl-radical scavenging activity of hydrogen does not significantly contribute to its biological function. bioRxiv. 2021 Mar 13; 435216.

9. Poulos, Thomas L . Heme Enzyme Structure and Function.[J]. Chemical Reviews, 2014.