【陈巍学基因

本次主要介绍一下DNA的甲基化和羟甲基化的高通量测序。DNA的甲基化是在DNA的序列不变的条件下，在其中某些碱基上加上甲基的这样一个过程。

DNA甲基化的结果，一般是使甲基化位点的下游的基因表达量变少。

DNA甲基化

化学反应

这个（甲基化）分析方法当中的核心化学反应，是用亚硫酸氢盐来处理DNA。DNA当中，没有甲基化或羟甲基化的C碱基，就会被转化成U碱基。我们来看这个转化的过程，在弱酸性条件下，亚硫酸氢根会结合到没有甲基化的C碱基的6位。而甲基化了的C碱基不会和亚硫酸氢根发生这个反应的。

然后，用碱来处理。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C，就被脱氨基，并且脱亚硫酸根。然后，就被转化成U碱基。

那么，甲基化或者羟甲基化的C碱基，因为之前没有和亚硫酸氢根起反应，所以现在用碱来处理，它也不会发生脱氨基反应。所以，它还保持了是“C”。用亚硫酸氢盐来处理DNA，可以让99%左右的非甲基化的C碱基变成U。也就是说这种方法的的转化效率非常高，转化效率达到了99%。

它的优点，就可以让我们接下来通过高通量测序的方法，可以精确地看到单个碱基的甲基化的水平。经过亚硫酸氢盐转化过的DNA，再经过PCR，PCR新合成出来的链，U碱基的位置，就会被替换成了“T”。那么在接下来的测序过程中，测到的也是T碱基。而甲基化的C，因为没有被亚硫酸氢盐所转化，所以，在接下来的测序过程中，被测到的，还是“C”碱基。这样，通过测序，看一个位置是“C”，还是“T”。如果它保持是“C”，就说明这个位置是被甲基化、或者羟甲基化了。如果测到的是“T”，就说明这个位置是没有被甲基化、或者羟甲基化。

建库方法

甲基化的建库过程。

• 第一种，用Illumina公司的Truseq DNA建库方法，来做甲基化测序。

因为Illumina Truseq DNA建库试剂盒当中，它所提供的接头，那么这个接头上的C碱基都是已经经过甲基化修饰了。所以，用这些接头做出来的文库，在用亚硫酸氢盐做转化的过程当中，它的（接头上的）C还是保持是C ，不会被转成U。带了这些接头的文库分子，就可以和测序芯片上的草皮DNA发生互补杂交。并且进一步发生桥式PCR反应。生成测序用的DNA的簇（Cluster）。但是，这个方法有一个缺点，就是在用亚硫酸氢盐处理DNA文库的时侯，90%以上的DNA链会断掉。这样，已经建好的文库，其中90%分子会被破坏掉。也就是说文库的丰富度就会损失90%以上。那么，相应的它有它的好处，它的好处就是，在这个建库过程当中用的PCR循环数较少。所以它PCR扩增效率不同，所引起的文库不均一程度也就较低。也就是我们通常所说的PCR bias较少。

• 第二种建库方法。为了解决文库丰富度受到损失的这个问题，EpiCentre公司开发了EpiGnome方法，方法的操作过程如图。

第1步，亚硫酸氢盐先处理DNA，把未甲基化的C都转变成U。

第2步，把带标签1的随机引物加入，进行第一次的复制。得到第1条的复制链。

第3步，是消化掉过量的引物。

第4步，是加入带末端终止碱基、并带标签2的随机引物。这个引物的作用是让第1复制链延伸，并且加上标签2。

第5步是加入建库的PCR引物，进行PCR。通过PCR，把Index序列和成簇引物序列加入到链的两侧。得到真正的文库。

这个方法的优点是，把亚硫酸氢盐处理的过程，放在了建库之前。这样建成的库的丰富程度会比较高。但是这个方法也有缺点，缺点就是要做较多的PCR循环，那么有了比较多的PCR循环之后，PCR产物的扩增均一性是不太好的。也就是说PCR bias会比较大。

上述两种方法，各有优缺点。

HiSeq2000/2500****测甲基化文库的问题、和解决方案

在Illumina的HiSeq 2000或者2500平台上进行测序，如果文库是碱基平衡的文库，也就是说，每个特环当中，A/C/G/T四种碱基的比例，各占25%左右的话，测序仪对碱基的判读会比较好。但是如果缺少了一种或者几种碱基，测序仪对碱基的判读就会出问题。测序得到的数据质量就会下降。并且效的数据产量也会降低。因为甲基化文库中经过亚硫酸氢盐处理，绝大多数的C都变成了T。所以，这个文库中是严重地缺少C碱基的，也就是四种碱基的比例是严重不平衡的。这样在用HiSeq 2000或2500测序仪来测甲基化文库的过程当中，文库测序得到的数据质理就较差。并且经过PF过滤得到的有效的数据产量也会较低。

为了弥补甲基化文库的碱基不平衡性，一般情况下，在上机过程当中，是掺入大比例的基因组文库，或者PhiX文库，来补充比较多的C碱基，一般会掺30%的PhiX文库、或者基因组文库。

在掺入30%的PhiX文库的条件下，一条HiSeq 2000 V3 PE100的Lane，大概可以得到20G 左右的甲基化文库数据。也就是说，在HiSeq 2000或者2500平台上，甲基化文库的测序数据产量，一直都不是很高。质量也比较低。

羟甲基化测序

接下来，我们说一下区分“羟”甲基化和甲基化的测序方法。

在用单纯的亚硫酸氢盐法来测的过程当中，甲基化和差甲化的C碱基都不能被转化成U碱基，所以单纯的亚硫酸氢盐法是无法区分甲基化或羟甲基化的C碱基的。

为了区分甲基化和羟甲基化，科学家想出了两种办法。

• 第一种办法，是通过高钌酸钾（KRuO₄）来氧化羟甲基化的C。羟甲基化的C可以被转化成甲酰化的C碱基，而甲酰化的C碱基，是可以被亚硫酸氢盐转化成U的。

而甲基化的C，不会被转化成U。这样就把原来的羟甲基化的C和甲基化的C给区分开来了。

经研究表明，用高钌酸钾氧化的方法来氧化羟甲基化的C，其转化效率是94%左右。也就是说，每100个羟甲基化的C中，有94个会被高钌酸钾转化成甲酰化的C。并进一步被亚硫酸氢盐转化成U。同时，原来的甲基货摊C，只有2.1%会被转化成甲酰化的C。

• 第二钟区分羟甲基化C的方法，是用糖基把羟甲基化的C给保护起来。然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1），把甲基化的C转化成羟基化的C。

进一步将羟甲基化的C转化成甲酰化的C和羧基化的C。甲酰化的C和羧基化的C都可以被亚硫酸氢盐转化成U。而之前被糖基化保护起来的羟甲基化的C，是不会被TET蛋白转化成甲酰化的C或者羧基化的C的。在亚硫酸氢盐的处理过程中，它还保持是C。并且在之后的PCR扩增产物中，也表现为C。这样，就可以把羟甲基化的C，和甲基化的C，给区分开来。

用这个方法，没有甲基化的C，99.6%都被转化成了U。甲基化的C，97.7%都被转化成了U。而羟甲基化的C，只有8%被化成了U。也就是说92%的羟甲基化的C得到了糖基的保护，还保持了C。上述，就是目前2个区分羟甲基化的C和甲基化C的方法。

设置内参

在甲基化文库建程当中，亚硫酸氢盐对未甲基化的C的转化效率并不是100%，一般是在99%左右。为了对实验的转化效率进行质量控制。一般会在转化实验当中加入内参对照品。一般情况下，是用甲基化酶缺陷型的大肠杆菌，所生产出来的完全没有被甲基化的λ（噬菌体）DNA，或者pUC19（质粒）DNA做内参。来看一次实验当中C的转化效率。一般情况下，实验当中是加入1%的完全没有甲基化的λ DNA做内参。

同样道理，也可以通过用甲基化酶处理过的，CpG岛完全被甲基化的DNA，来跟踪甲基化DNA对亚硫酸氢盐转化的抵抗效果。

数据分析

最后，我们来谈一下，甲基化测序后的数据处理。

因为亚硫酸氢盐处理过后，绝大部分的C都被转化成了T。这样，测出来的序列在和基因组进行对比的时侯，直接对比是对比不上的。为了要进行比对，就要把基因组的碱基做两种转变。

• 第一种转变是把基因组上所有的C都改到T，再来和测序测到的序列来对比。这样，就可以把原来的链给对比上。

• 第二种转变，是把基因组上所有的G都变成A，这样才能和经过PCR得到的原样本链睥互补链对比得上。这样做的原因，是原样本链的互被链，它上面绝大部分的G，都被变成了A。所以，只有把（参考）基因组上的G，也都改成A，这样才能对比得上。比对上之后，再来看哪些碱基是没有被转化的。这样，就可以确认这些碱基的甲基化修饰情况了。