|
近日，德国科学家于Nature Plant 发表综述文章“CRISPR–Cas-mediated chromosome engineering for crop improvement and synthetic biology”，文章针对现有运用染色体工程育种的困境，打破遗传连锁，提高重组率及染色体大片段倒位、易位等问题进行了总结，同时预期基于 CRISPR Cas的染色体工程新工具，将让科学家有可能在未来合成植物染色体，甚至创建新植物物种。 CRISPR Cas系统由一种DNA内切酶组成，这种酶能够在基因组的几乎任何位置诱导双链断裂 (DSBs)，并被合成的sgRNA引导到所需的剪切位点。诱导的DSB通过内源性DNA修复途径进行修复，如非同源端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR)。随着CRISPR技术的发展，CRISPR Cas技术作为一种基因组编辑工具引领了作物改良的新时代，为科学家带来无限可能。 植物育种依赖于在减数分裂期间同源染色体间遗传物质的相互交换，从而产生新的等位基因组合。杂交可以使优良作物的有利性状组合起来，并消除不利性状。然而，由于自然过程中的交叉率和分布受到高度限制，不太可控，染色体的主要部分不参与遗传交换。因此，理想的重组结果是非常有限的，连锁阻力往往是不可避免的。解决这个问题的一种方法是创造减数分裂重组机制缺陷突变体，从而提高同源亲本染色体之间的全局交叉频率。 植物减数分裂重组机制由众多因素影响，在植物中发现的第一个交叉限制因子是解旋酶Fanconi anaemia complementation group M (FANCM)。fancm的突变导致拟南芥（a. thalian）的交叉频率增加了3倍。第二个解旋酶是BLM同源蛋白RECQ4，被鉴定为交叉拮抗剂。拟南芥拥有两个紧密相关的同源蛋白RECQ4A和RECQ4B35。recq4a和recq4b(以下简称recq4a/b) 双突变体的交叉频率增加了6.2倍。还有更多案例，小编不再赘述。值得注意的是，它们对染色体中间位置的重组没有影响，产生低重组区域，如中心体(pericentromeric)或着丝粒周围区域，保持不变。 植物减数分裂重组机制的运用确实提高了交叉频率，但是并没有改善产生重组的区域。因此，一个明显的策略是在减数分裂过程中直接靶定这些区域，引入DSBs并诱导同源重组。原则上，可以使用两种不同的方法来实现这一目标:使用可编程的DNA核酸酶诱导DSB或使用其DNA结合能力引导自然的DSB诱导机制到各自的靶点。确实，在酵母和拟南芥中，研究人员基于内源的SPO11 符合伴侣，以CRISPR Cas系统作为DNA结合蛋白招募SPO11作为减数分裂DSB诱导的天然介质（图1）。结果表明，在减数分裂中DSB形成被抑制的区域，如着丝粒和着丝粒间区域，仍然无法被spo11介导的DSB诱导，这意味着该系统存在局限性。 虽然，目前还没有关于减数分裂位点特异性dbs直接诱导的报道，但是科研人员利用Cas9定向诱导DSB成功诱导了番茄体细胞同源染色体之间的重组。该研究小组利用两份基因差异显著的番茄材料，在杂交植株的植烯合成酶1基因中诱导出等位基因特异性的DSB。通过水果颜色的测定，能够区分NHEJ和同源重组修复结果之间的区别。进一步的SNP重分布分析发现，除了nhej介导的修复外，还会发生体细胞同源重组事件，包括基因易位和一个推定的交叉。这些成果预示着植物同源染色体间重组中的靶向DSB诱导的巨大潜力。另外，哺乳动物和酵母中CRISPR cas介导的染色体工程也取得了一定的进展。 图 1 通过调节交叉控制因子来增强减数分裂交叉 研究发现许多作物都携带染色体重排。利用染色体规模的序列集合来捕获作物的全基因组，可以检测作物的序列多样性。在当前大麦优良种质的基因组比对中，主要检测到超过5mb的大型倒位多态性。因此，许多遗传资源目前还无法用于育种，这意味着有针对性地诱导或逆转进化衍生的染色体重排技术对育种者具有重要价值。目前已有一些报道，通过定向诱导交叉和倒位控制遗传交换。例如2019年，Schmidt等人证明了使用金黄色葡萄球菌Cas9在卵细胞特异性表达诱导拟南芥高达18kb的染色体靶向倒位。在一项后续研究中，Schmidt等人更进一步，逆转了拟南芥(a . thaliana)染色体进化衍生的倒位，即众所周知的在很多物种遗传物质中都有携带的异染色质纽hk4S，它的大小为1.17 Mb。研究人员在38个主要转化株中检测到7个独立的倒位事件。这一概念验证研究表明，还应该有可能在作物植株中诱导或逆转百万级碱基范围内的倒位。另一个研究小组则专注于是否可以恢复减数分裂重组的杂种，恢复旋钮为杂合子状态。同样取得了积极进展。 图 2 通过定向诱导交叉和倒位控制遗传交换 在随后的研究中，科研人员相继在LanDSBerg erecta以及玉米等作物中获得了染色体大片段交叉和倒位的株系。因此，染色体工程方法已经在农作物中铺平了道路，在不久的将来可能会取得快速进展。染色体反转的诱导或反转可用于作物改良，通过物理分离打破遗传连锁群，或在以前重排的区域恢复交叉(图2)。倒位的诱导可用于稳定有利性状之间的遗传链(图2)。这种人工倒位将使该区域无法在减数分裂期间进行同源染色体之间的重组。 与倒位一样，作物中常见的大片段易位会导致减数分裂重组的减少。植物的互易位可引起半不育，可能涉及雄性不育、雌性不育，或者两种类型同时不育。因此，定向诱导易位可能是育种家打破或稳定遗传连锁的重要工具。连锁可以通过物理分离打破，也可以通过将来自同一染色体上不同染色体的有利基因组合而建立(图3)。最近，在植物中首次实现了相互易位的靶向诱导。Beying等能够在拟南芥1号染色体和2号染色体之间以及1号染色体和5号染色体之间诱导染色体互易位。易位片段大小分别为1 Mb和0.5 Mb左右。这些易位是可遗传的，在T2单株中检测到的易位频率在野生型背景下高达2.5%，在经典突变体ku70中高达3.75%。这项概念性的验证研究具有积极的意义，为将来运用于作物育种提供了基础。 图 3 通过相互易位的定向诱导调控遗传连锁 综上所述，目前科学家已经可以改变染色体内和染色体之间的基因顺序。不难想象，重新构建染色体，甚至合成染色体或合成新植物物种，在不久的将来将成为可能。在整个进化过程中，出现了多种染色体重排，它们可以作为CRISPR cas介导的染色体工程可能实现的基因组变化的模型。染色体重排经常发生在多倍体化事件之后，随后发生异倍体变化，最终形成二倍体染色体组。因此，无论是通过嵌套的染色体插入还是通过端到端易位，都有可能实现染色体数量的减少，这两种方法都是很好的自然染色体重排。例如小麦或马铃薯这样的多倍体物种，正是这类染色体工程潜在的候选材料。此外，在植物基因组进化过程中，着丝粒的重新定位时有发生。最近，在伽玛射线辐射后的玉米材料体内也有发现。由于可以在进化的尺度上诱导高频率的倒位和易位，在不久的将来也可以通过改变着丝粒的成分和染色体数目来模拟自然的染色体进化形成(图4)。 图 4 植物染色体工程的未来展望 由于对减数分裂重组的控制等原有染色体工程技术的局限性，限制了从零开始制造合成植物染色体的可能性，合成植物染色体及新植物物种可能将通过CRISPR cas介导的染色体工程，结合合成DNA的小片段来实现。新的植物染色体工程的建立，开启了作物改良领域令人兴奋和前所未有的可能性，将有助于拓宽对进化和遗传学的理解。 引用文献： https://www./articles/s41477-021-00910-4 |
|
|
