CRISPR重大危机－NBT特邀基因编辑大牛Kim Jinsoo点评

Cas9可以诱导广泛的在sgRNA结合位置的损伤，包括大的缺失，倒位和插入。

一石激起千层浪，在靶点位置出现大的片段的活性的问题，正日益成为人们最终使用Cas9用于临床实验的障碍。

Cas9由gRNA引导的内切核酸酶活性，在细菌中的适应性免疫系统中被发心啊，相应的工具开发在人类治疗中具有很大的前景，使用CRISPR-Cas9的临床试验目前正在美国和中国进行。对于基于CRISPR的治疗剂的临床使用的长期公认的潜在限制是与脱靶效应相关的安全性问题，所述脱靶效应导致切割与靶位点高度同源的并不希望被编辑的DNA位点。Kosicki等人表明除了脱靶效应外，CRISPR-Cas9的靶向作用也是不可预测的，复杂的，并且可能存在问题。这表明在人类治疗应用中采用CRISPR时可能需要更加谨慎。

Cas9核酸酶以指导RNA（gRNA）依赖的方式切割染色体DNA，在细胞中产生位点特异性DNA双链断裂（DSB），其通过同源重组或非同源末端连接（NHEJ）的修复产生希望的遗传修饰。为了破坏X连锁的PigA基因，Kosicki等人首先将针对该基因的内含子或外显子位点的Cas9和gRNA引入雄性小鼠胚胎干（ES）细胞。出乎意料的是，单个gRNA靶向位于距离最近的外显子数百到数千碱基对的内含子位点，可能作为阴性对照，产生频率为5-20％的PigA缺陷细胞，表明DSB修复可能涉及大的缺失延伸长达数千碱基对。此外，他们选择常染色体Cd9基因座以显示靶向远端内含子位点的gRNA也产生Cd9缺陷细胞。显然，这些事件不限于某些基因座或等位基因数或细胞类型或Cas9表达或递送方法。作者观察到两个小鼠胚胎干细胞系，小鼠造血干细胞和人类女性色素性视网膜上皮细胞中单等位基因和双等位基因位点的单个gRNA介导的大型缺失，无论Cas9的表达或递送是否是稳定整合或者瞬时转染的。

由单个Cas9诱导的切割引起的高频率的大缺失是出乎意料的，因为人们普遍认为Cas9触发的诱变NHEJ导致DSB位点处<20个碱基对的小插入或缺失（插入缺失）。大多数研究人员之前忽略大的缺失，因为这些事件不能通过常规的短程PCR和基因分型方法检测到，以检测靶位点附近的局灶性突变。值得注意的是，Kosicki等人没有进行基因分型以获得基因敲除细胞。他们首先在选择条件下分离敲除细胞，然后进行基因分型，这是一种不怎么常用的基因技巧。

为了详细了解和表征这些分子事件，作者使用长程PCR和PacBio或Sanger测序仔细分析了一组PigA或Cd9缺陷细胞和单细胞衍生的PigA或Cd9缺陷克隆。正如所料，大多数编辑的等位基因包含跨越靶位点和最近的外显子的高达9.5千碱基的染色体DNA的大量缺失。大部分（17％）的编辑事件涉及复杂的，通常是非连续的突变，例如从其他染色体插入DNA片段，倒位，重复和除了大的缺失之外的单核苷酸变异。很难将所有这些不寻常的突变等位基因作为PCR或测序工件的问题。由两个核酸酶诱导的两个同时发生的DSB的修复经常引起易位，反转，重复和大的缺失，但是单个DSB如何引起这种复杂的重排是一个谜。

Kosicki等人警告说，广泛的靶向损伤，特别是涉及易位的损伤，可能激活人类基因组中数百种休眠癌基因中的一种，导致患者癌症，使人联想到基因治疗后逆转录病毒插入后LMO2致癌基因激活。治疗X连锁严重联合免疫缺陷。考虑到靶基因位点上基因组重排的复杂性和不可预测性，人们不能排除转染CRISPR-Cas9的数十亿细胞中具有偶然原癌基因激活的单个细胞可能增殖的可能性。在离体治疗中，使用长程PCR和使用RNA-seq潜在的癌基因转录监测靶向突变是有必要的，如果不是足够的话。如果可能的话，应该选择单细胞衍生的克隆，在全基因组测序后没有观察到异常的靶上损伤或脱靶突变。例如，可以在体外扩增之前对基因编辑的诱导多能干细胞的克隆群体进行测序。通过在植入种系基因编辑之前对卵裂球进行测序，还可以校正人胚胎并检查基因组完整性。

最近，Kim的小组和其他人使用特异于CRISPR-Cas9的MYBPC3突变等位基因来纠正导致Cas9靶位点杂合的人胚胎中的肥大性心肌病的突变。使用野生型母体等位基因而不是合成寡核苷酸模板修复突变体父本等位基因中绝大多数Cas9诱导的DSB，表明同源重组（IHR）是人胚胎中的显性DSB修复途径。 Egli等[质疑了这一结论，他提出了其他假设，如大型缺失或染色体丢失，并要求进行其他分析，包括长程PCR。

为了回应这种合理的批评，Kim和Mitalipov小组（未发表的数据）最近使用长程PCR和单核苷酸多态性（SNP）基因分型分析了从基因校正胚胎中分离的基因组DNA，以排除大量缺失的可能性。提供IHR的直接证据。值得注意的是，在Kosicki等人的研究中，一些Cd9编辑的等位基因具有局部杂合性缺失或两个同源染色体的交叉，似乎显示出IHR的证据。这表明，尽管两项研究中的实验设置不同，但可能涉及类似的机制。修复DSB。

Kosicki等生成的数据无疑提高了在体细胞和种系基因治疗中安全使用CRISPR-Cas9基因编辑工具的标准。除了脱靶效应之外，必须仔细监测并在未来的临床试验中控制可能的目标效应。在这方面，令人鼓舞的是，自2013年以来，研究人员已经做出了相当大的努力来定义和控制全基因组CRISPR脱靶效应，为更安全的治疗基因编辑奠定了基础。 CRISPR靶向位点上的大缺失，复杂重排和IHR的确切机制仍然未知，需要进一步研究。与往常一样，我们学的越多，我们的问题就越多。