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Development of a CRISPR/Cas9 genomeediting toolbox for Corynebacterium glutamicum
本文由中科院天津工业生物技术研究所孙际宾课题组于2017年11月17日发表在Microb Cell Fact。
谷氨酸棒状杆菌是重要的工业生产菌，可用于生产各类氨基酸及天然/非天然产物。作者开发的CRISPR/Cas9 基因编辑工具基于Cas9和gRNA表达盒重构，Cas9和gRNA质粒共转化方法不仅克服了Cas9毒性还促使gRNA有效终止。本技术的基因敲除和基因插入效率分别达到60.0%和62.5%，另外开发的CRISPRCas9介导的ssDNA 重组能够精准的引入和点突变，效率超过80%。此方法也可对谷氨酸棒状杆菌进行双位点有效编辑。
文章脉络
1、优化Cas9 和gRNA的表达：用严格调控的Ptac启动子诱导调控Cas蛋白表达，组成型启动子P11F调控gRNA，TrrnB终止转录。
2、基因敲除与插入：以SL4（ATCC13869 衍生菌株，电转效率高）为出发菌，先电转pCas9质粒，再电转携带模板的pgRNA质粒，ldhA基因缺失阳性率8%，分析原因发现假阳性菌cas9基因或被删除，或无义突变失活，或者转座酶插入失活。本文作者开发的两质粒共转化方法，可减少pCas9的复制，Cas9突变减少，细胞阳性突变率达到47.3± 11.9%，基因插入效率25.0±8.3%。
3、CRISPR/Cas9和RecT介导ssDNA定向重组：按图1流程，六个碱基插入编辑效率86.7±5.8%，三碱基突变编辑效率70%。
图1：CRISPR/Cas9和RecT介导的ssDNA定向重组SL4ΔldhA:: rfp
4、质粒消除：连续两次无抗消除质粒，消除效率约25.0%。
5、普适性：降低IPTG诱导浓度后，此编辑工具同样适用于野生菌株ATCC13969和ATCC 13032，基因缺失/插入编辑效率如下表1。另外，此编辑工具点突变效率90.0%，双位点点突变效率40.0%。
表1：在谷氨酸棒状杆菌中CRISPR/Cas9介导的基因缺失和插入
DOI：10.1186/s12934-017-0815-5
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