通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法与流程

技术特征：

1.通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，包括如下步骤：

（1）设计了新的gRNA序列，设计在BMP2a第一个外显子和内含子之间，gRNA序列为GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG，酶切为HinfI；

（2）设计并合成gRNA引物，引物见表1：

表1——CAS9BMP2a的引物序列为设计的P3:

Forward sequence (5’to3’):CCTCTTCAACCTGACCTCCA；

Reverse sequence (5’to 3’):GTCCGTCTGTGGTCCACTTT；

P3：GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGCCCATCACTAGACTCTGTTTTAGAGCTAGAAAT；

p4：AAAAGCACCGACTCGGTGCC；

gRNA序列GGAGCCCATCACTAGACTCTTGG；

（3）将设计的引物进行PCR，PCR体系如下：

gRNA- plasmid 10 ng；

P3 1 ul(10 pmol)；

P4 1 ul(10 pmol)；

Buffer 10；

dNTP 8；

KOD 0.5；

ddH2O Up to 100 ul；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入三步循环（95℃-20s、58℃-20s、72℃-20s共30个循环），然后72℃-10min，最后保温在16℃；电泳检测PCR产物后，进行纯化；

(4) RNA-Free条件下，将gRNA进行体外转录，体系为：

2.5mmol/L NTP 4ul；

10× Reaction Buffer 2ul；

Template DNA 1 1ug(<6ul)；

T7 Enzyme Mix 2ul；

DEPC Water up to 20ul ；

gRNA 12.5(ng/ul)；

Cas9 300(ng/ul)；

Tris-Hcl 0.2ul；

Phenol-red 0.2ul；

DEPC Water up to 2ul ；

以上体系37°C ，1 hour反应完毕，然后进行纯化；

(5) 将前述纯化的mRNA 注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，4天后提取RNA,转录DNA进行测序检测；注射体系如下：

gRNA 12.5(ng/ul)；

Cas9 300(ng/ul)；

Tris-Hcl 0.2ul；

Phenol-red 0.2ul；

DEPC Water up to 2ul；

(6)三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到一定概率的杂合子，将胚胎后进行ＲＮＡ提取并转录成ＤＮＡ送测序查看是否有突变，这时候的ＤＮＡ还是双链的；然后将测序后发现突变的斑马鱼的ｃＤＮＡ和１９Ｔ载体相连接后，将其在培养基中滚珠图板，经过１２－１４小时后，已经连接的质粒会以斑点形式成长，将其挑斑后，得到的是单链的ＤＮＡ，再次送测序，最终得到单链的突变，然后将其培养长大三个月后性成熟后，将突变的斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交，得到胚胎后查看是否有突变，将突变的斑马鱼挑单克隆测序后养起来；

(7) 经过三个月后性成熟后，第二代的突变成年的雄鱼与雌鱼再次切除尾巴，进行鉴定，详见步骤（6），得到相同突变（缺失几个碱基）的斑马鱼再次交配，从而得到纯合BMP2a敲除的斑马鱼。

2.如权利要求1所述的通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法，其特征为；步骤（3）和步骤（4）中的纯化方法包括如下步骤：

(A) 加入体积为1：2-3的水和苯酚/氯仿/异丙醇, 混匀后10,000-15,000 rpm离心5min. 上层移入新的管子，重复该步骤一次；

(B)上层移入新的管子，加入150ul氯仿,离心5 min；

(C)加入1/10体积2.5 M醋酸钠以及2.5体积乙醇,-70C冷冻30min；

(D)离心10,000-15,000rpm在4C 15min；

(E)弃掉溶液留沉淀，加入 200ul 80%乙醇,离心5 min，弃掉溶液，干燥后用10-20µl DEPC H2O溶解。